بروتوكول المصحوبة بمرشدين لتوصيف الجراثيم البراز بتسلسل الرنا الريباسي-Amplicon 16S
Summary
ويصف هذه المخطوطة بروتوكول موحد مفصلة لتسلسل الرنا الريباسي amplicon الفائق 16S. ويدخل البروتوكول بروتوكولا المتكاملة ويرتدون الزي العسكري ومجدية وغير مكلفة بدءاً من جمع عينات البراز من خلال تحليل البيانات. ويتيح هذا البروتوكول تحليل عدد كبير من العينات مع المعايير الصارمة والعديد من عناصر التحكم.
Abstract
ميكروبيومي المعوية البشرية تلعب دوراً مركزياً في حماية الخلايا من الضرر، وفي تجهيز الطاقة والمواد الغذائية، وفي تعزيز الحصانة. خروج ما يعتبر تكوين صحي الحجمية (ديسبيوسيس) قد تنال من الوظائف الحيوية مما يؤدي إلى ظروف مرضية. تم توجيه جهود البحوث الحديثة والجارية نحو توصيف الرابطات بين تكوين الجراثيم وصحة الإنسان والمرض.
التقدم في تكنولوجيا التسلسل الفائق تمكين خصائص تكوين القناة الهضمية الجرثومية. وتشمل هذه الأساليب تسلسل الرنا الريباسي amplicon 16S وتسلسل بندقية. يستخدم تسلسل الرنا الريباسي amplicon 16S التشكيل الجانبي التكوين تصنيفية، بينما التسلسل بندقية يوفر معلومات إضافية حول التنبؤات الجينات والشرح الوظيفي. هو ميزة في استخدام أسلوب تسلسل مستهدفة من منطقة متغير مورثة الرنا الريباسي 16S تكلفة أقل بكثير مقارنة بتسلسل بندقية. اختلاف تسلسل الجين الرنا الريباسي 16S تستخدم كبصمات الأصابع الميكروبية لتعريف وتحديد كمية الأصناف المختلفة داخل نموذج فردية.
جندت الجهود الدولية الرئيسية المعايير لتسلسل الرنا الريباسي amplicon 16S. ومع ذلك، العديد من الدراسات تقرير مصدر مشترك للتباينات الناجمة عن تأثير دفعة. لتقليل هذا التأثير، يرتدون الزي العسكري بروتوكولات لجمع العينات، المعالجة، وتسلسل يجب أن تنفذ. ويقترح هذا البروتوكول دمج البروتوكولات المستخدمة على نطاق واسع بدءاً من جمع عينات البراز لتحليل البيانات. ويشمل هذا البروتوكول نهج مباشر-بكر خالية من الأعمدة، التي تمكن من معالجة متزامنة واستخراج الحمض النووي لعدد كبير من عينات البراز، جنبا إلى جنب مع [بكر] تضخيم المنطقة V4. وبالإضافة إلى ذلك، يصف خط الأنابيب تحليل البروتوكول ويوفر برنامج نصي باستخدام أحدث إصدار من قييمي (قييمي 2 النسخة 2017.7.0 و DADA2). ويهدف هذا البروتوكول خطوة بخطوة لتوجيه الراغبين في بدء استخدام تسلسل الرنا الريباسي amplicon 16S بطريقة قوية، والإنجاب، وسهلة الاستخدام، ومفصلة.
Introduction
كما بذلت جهود مركزة لتحسين فهم التنوع ميكروبيومي والوفرة، كجانب آخر من التقاط الاختلاف والتشابه بين الأفراد في ظروف صحية ومرضية. 2،سن3والجغرافيا4، نمط الحياة5،6، والمرض5 عرضت أن تكون مقترنة بتكوين ميكروبيومي القناة الهضمية، ولكن العديد من الشروط والسكان لم تماما وتتميز. مؤخرا قد أفيد أنه يمكن تعديل ميكروبيومي للتطبيقات العلاجية7،،من89. ولذلك، أفكاراً إضافية في العلاقة بين مختلف الظروف الفسيولوجية وتكوين الجراثيم هو الخطوة الأولى نحو الاستغلال الأمثل للتعديلات المستقبلية المحتملة.
الأساليب التقليدية الثقافة الميكروبية محدودة بسبب انخفاض حجم الغلة10،11، وتصور كدولة ثنائية فيها بكتيريا أما الموجودة في القناة الهضمية أو لا. تسلسل الحمض النووي القائم الفائق ثورة الإيكولوجيا الميكروبية، تمكن القبض على جميع أعضاء المجتمع الميكروبية. ومع ذلك، قراءة تسلسل طول ونوعية ما زالت حواجز كبيرة أمام تصنيف دقيق التعيين12. وعلاوة على ذلك، قد تعاني الفائق استناداً إلى تجارب من آثار دفعة، حيث تتأثر القياسات بالمتغيرات غير البيولوجية أو غير العلمية13. في السنوات الأخيرة، وضعت عدة برامج لدراسة ميكروبيومي البشري، بما في ذلك المشروع “الأمريكي القناة الهضمية”، وهذا المشروع ميكروبيومي البشرية في “الولايات المتحدة” (الولايات المتحدة)، ومشروع ميتاهيت “المملكة المتحدة” (المملكة المتحدة). وقد ولدت هذه المبادرات كميات هائلة من البيانات التي لا يمكن مقارنتها بسهولة بسبب الافتقار إلى الاتساق في النهج التي تتبعها. حاولت مجموعة متنوعة من مشاريع دولية مثل الاتحاد الدولي ميكروبيومي البشرية، والمشروع “المعايير الدولية ميكروبيومي البشرية”، والمعهد الوطني للمعايير والتكنولوجيا (NIST) لمعالجة بعض هذه القضايا14 ، ووضعت معايير لقياسات ميكروبيومي التي ينبغي أن تمكن من تحقيق النتائج الإنجابية يمكن الاعتماد عليها. الموصوفة هنا بروتوكول متكامل عن الأساليب المستخدمة على نطاق واسع عدة15،16 ل 16S الرنا الريباسي الفائق التسلسل (16-seq) بدءاً من جمع عينات البراز من خلال تحليل البيانات. البروتوكول يصف نهج بكر خالية من الأعمدة، صممت في الأصل لاستخراج مباشرة من النبات الحمض الخلوي الصبغي16، تمكين المعالجة متزامنة من إعداد كبيرة من البراز العينات في فترة زمنية قصيرة نسبيا ذات جودة عالية تضخيم الحمض النووي لاستهداف ترتيب المنطقة V4 المتغير الميكروبية على منصة تسلسل مشتركة. ويهدف هذا البروتوكول إلى توجيه العلماء المهتمين في بدء استخدام تسلسل الرنا الريباسي amplicon 16S بطريقة قوية، والإنجاب، وسهلة الاستخدام، ومفصلة، باستخدام عناصر هامة. وجود بروتوكول المصحوبة بمرشدين ومفصلة خطوة بخطوة يمكن تقليل تأثير دفعة وهكذا سوف تسمح نتائج التسلسل أكثر قابلية للمقارنة بين مختبرات.
Protocol
Representative Results
Discussion
16S الرنا الريباسي-أمبليكون وتسلسل بندقية metagenomics اكتسبت شعبية في الميكروبيولوجيا السريرية التطبيقات21،22,23. هذه التقنيات مفيدة في زيادة القدرة على التقاط الأصناف كولتورابل وغير كولتورابل، توفير بيانات عن الوفرة النسبية للعدوى المسببة للمرض، وقدرتهم على تح?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
بتأييد هذا العمل جزئيا بالبرنامج الأساسية (المنح رقم 41/11)، ومؤسسة العلوم إسرائيل (منحة رقم 908/15)، وكرون الأوروبية والمنظمة التهاب القولون (إيكو).
Materials
| Primers | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Extraction solution | Sigma-Aldrich | E7526 | |
| Dilution solution | Sigma-Aldrich | D5688 | |
| Kapa HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit | KAPABIOSYSTEMS | KK2601 | PCR Master mix |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent kit | Invitrogen | P7589 | dsDNA quantify reagent |
| MinElute Gel extraction kit | Qiagen | 28606 | |
| Agarose | Amresco | 0710-250G | |
| Ultra Pure Water Dnase and Rnase Free | Biological Industries | 01-866-1A | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Molecular probes | Q32854 | dsDNA detecting kit |
| High Sensitivity D1000 | Agilent Technologies | Screen Tape 5067-5582 | separation and analysis |
| Screen Tape Assay | Agilent Technologies | Reagents 5067-5583 | for DNA libraries |
| PhiX Control v3 | Illumina | 15017666 | control library |
| MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle) | Illumina | MS-102-2003 | |
| Ethidium Bromide | Amresco | E406-10mL-TAM | |
| 2 mL collection tubes | SARSTEDT | 72.695.400 | Safe Seal collection tubes |
| Plastic stick swab in PP test tube | STERILE INTERIOR | 23117 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| PCR Machine | Applied Biosystems | 2720 Thermal Cycler | |
| Sequncing Machine | Illumina | Miseq | |
| PCR workstation | Biosan | UV-cleaner | |
| scissors | |||
| vortexer | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 |
References
- Braun, T., et al. Fecal microbial characterization of hospitalized patients with suspected infectious diarrhea shows significant dysbiosis. Scientific Reports. 7, 1088 (2017).
- De Filippo, C., et al. Impact of diet in shaping gut microbiota revealed by a comparative study in children from Europe and rural Africa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 14691-14696 (2010).
- Yatsunenko, T., et al. Human gut microbiome viewed across age and geography. Nature. 486, 222-227 (2012).
- Rodriguez, J. M., et al. The composition of the gut microbiota throughout life, with an emphasis on early life. Microbial Ecology in Health and Disease. 26, 26050 (2015).
- Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444, 1027-1031 (2006).
- McDonald, D., et al. An improved Greengenes taxonomy with explicit ranks for ecological and evolutionary analyses of bacteria and archaea. The ISME Journal. 6, 610-618 (2012).
- Bakken, J. S., et al. Treating Clostridium difficile infection with fecal microbiota transplantation. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 9, 1044-1049 (2011).
- Khoruts, A., Dicksved, J., Jansson, J. K., Sadowsky, M. J. Changes in the composition of the human fecal microbiome after bacteriotherapy for recurrent Clostridium difficile-associated diarrhea. Journal of Clinical Gastroenterology. 44, 354-360 (2010).
- Nood, E. V., et al. Duodenal infusion of donor feces for recurrent Clostridium difficile. The New England Journal of Medicine. 368, 407-415 (2013).
- Koplan, J. P., Benfari Ferraro, M. J., Fineberg, H. V., Rosenberg, M. L. Value of stool cultures. The Lancet. 316, 413-416 (1980).
- Platts-Mills, J. A., Liu, J., Houpt, E. R. New concepts in diagnostics for infectious diarrhea. Mucosal Immunology. 6, 876-885 (2013).
- Bokulich, N. A., et al. Quality-filtering vastly improves diversity estimates from Illumina amplicon sequencing. Nature Methods. 10, 57-59 (2013).
- Leek, J. T., et al. Tackling the widespread and critical impact of batch effects in high-throughput data. Nature Reviews Genetics. 11, (2010).
- Dubilier, N., McFall-Ngai, M., Zhao, L. Create a global microbiome effort. Nature. 526, 631-634 (2015).
- Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. PNAS. 108, 4516-4522 (2011).
- Flores, G. E., Henley, J. B., Fierer, N. A direct PCR approach to accelerate analyses of human-associated microbial communities. PloS One. 7, (2012).
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
- Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13, 581-583 (2016).
- Lozupone, C., Knight, R. UniFrac: A new phylogenetic method for comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 71, 8228-8235 (2005).
- Lozupone, C., Lladser, M. E., Knights, D., Stombaugh, J., Knight, R. UniFrac: An effective distance metric for microbial community comparison. The ISME Journal. 5, 169-172 (2011).
- Srinivasan, R., et al. Use of 16S rRNA gene for identification of a broad range of clinically relevant bacterial pathogens. PloS One. 10, e0117617 (2015).
- Hiergeist, A., Gläsner, J., Reischl, U., Gessner, A. Analyses of intestinal microbiota: culture versus sequencing. ILAR Journal. 56, 228-240 (2015).
- Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nature Reviews Genetics. 13, 601-612 (2012).
- Salipante, S. J., et al. Rapid 16S rRNA next-generation sequencing of polymicrobial clinical samples for diagnosis of complex bacterial infections. PloS One. 8, e65226 (2013).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. The ISME Journal. 6, 1621-1624 (2012).
