פרוטוקול מודרך לקבלת צואה אפיון חיידקים על ידי מטוסי אף-16 rRNA-אמפליקון רצף
Summary
כתב יד זה מתאר פרוטוקול מתוקננת מפורט של תפוקה גבוהה מטוסי אף-16 rRNA-אמפליקון רצף. הפרוטוקול מציג פרוטוקול משולב, לובשי מדים, ריאלי וזולה החל באיסוף הנתונים ניתוחים דגימת צואה. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח של מספר רב של דוגמאות עם סטנדרטים קפדניים מספר פקדים.
Abstract
Microbiome מעיים אנושיים ממלאת תפקיד מרכזי בהגנה על התאים מפני פגיעה, עיבוד אנרגיה וחומרים מזינים, ובקידום חסינות. סטיות מן מה נחשב קומפוזיציה microbiota בריא (dysbiosis) עשוי לפגום תפקידים חיוניים מובילים לתנאים פיפטות. מאמצי מחקר האחרונות ומתמשכים מכוונת כלפי אפיון השיוכים בין הרכב מיקרוביאלי, מחלה ובריאות האדם.
ההתקדמות טכנולוגיות רצף תפוקה גבוהה מאפשרים אפיון ההרכב חיידקים במעיים. שיטות אלה כוללות 16 rRNA-אמפליקון רצף ורצף רובה ציד. מטוסי אף-16 rRNA-אמפליקון רצף משמש פרופיל taxonomical הרכב, ואילו רובה רצף מספקת מידע נוסף אודות הגן תחזיות, ביאור פונקציונלי. יתרון באמצעות שיטה רצף יישוב של rRNA 16 גנים באזור משתנה הוא עלותו נמוכות משמעותית לעומת רובה רצף. רצף הבדלים ג’ין rRNA מטוסי אף-16 משמשים כמו טביעת חיידקים כדי לזהות ולכמת taxa שונים בתוך דוגמה אישית.
המאמצים הבינלאומיים הגדולים נשאר תקנים עבור מטוסי אף-16 rRNA-אמפליקון רצף. עם זאת, מספר מחקרים מדווחים ממקור משותף של וריאציה הנגרמת על ידי אפקט אצווה. כדי למזער את האפקט הזה, פרוטוקולים במדים לאיסוף הדגימה, עיבוד, ורצף חייב ליישם. פרוטוקול זה מציע השילוב של פרוטוקולים משמש בהרחבה מתחיל מאוסף דגימת צואה ניתוח נתונים. פרוטוקול זה כולל גישה ישירה-PCR ללא עמודים, המאפשרת טיפול בו זמנית, הפקת דנ א מספרים גדולים של דגימות צואה, יחד עם ה-PCR הגברה של אזור V4. בנוסף, הפרוטוקול מתאר את הצינור ניתוח ומספק קובץ script באמצעות הגירסה העדכנית ביותר של QIIME (QIIME 2 גירסה 2017.7.0 ו- DADA2). פרוטוקול צעד אחר צעד זה נועד כדי להנחות את אלו המעוניינים ליזום את השימוש מטוסי אף-16 rRNA-אמפליקון רצף בצורה איתנה, הרבייה, קל לשימוש, מפורט.
Introduction
מרוכזים מאמצים נעשו כדי להבין טוב יותר microbiome גיוון ושפע, כמו היבט נוסף של לכידת ההבדל ונקודות הדמיון בין אנשים בריאים ופתולוגיים בתנאים. גיל2,3, גאוגרפיה4,5,סגנון חיים6ו מחלה5 הוצגו להיות מזוהה עם ההרכב של microbiome הבטן, אבל התנאים אוכלוסיות רבות טרם אושרו במלואן מאופיין. לאחרונה דווח כי ניתן לשנות את microbiome עבור יישומים טיפוליים-7,–8,–9. לכן, נוספים תובנות לגבי מערכת היחסים בין מצבים פיזיולוגיים שונים ההרכב מיקרוביאלי הוא הצעד הראשון לקראת אופטימיזציה של שינויים עתידיים פוטנציאליים.
השיטות התרבות חיידקים המסורתית מוגבלים על ידי תשואות נמוכות10,11, נתפסים כמו מדינה בינארי חיידקים איפה גם להציג בבטן או לא. תפוקה גבוהה מבוסס DNA רצף יש מהפכה אקולוגיה מיקרוביאלית, הפעלת לכידתו של כל חברי הקהילה מיקרוביאלי. עם זאת, רצף לקרוא אורך ואיכות נותרו מכשולים משמעותיים טקסונומיה מדויק הקצאה12. יתר על כן, ניסויים לפי תפוקה גבוהה עלולים לסבול מתופעות אצווה, איפה מדידות מושפעים הלא-ביולוגיים או לא מדעי משתנים13. בשנים האחרונות הוקמו מספר תוכניות כדי ללמוד את microbiome האנושית, כולל הפרויקט בטן אמריקאי, פרוייקט Microbiome האנושי של ארצות הברית (ארה ב) של הפרויקט MetaHIT הממלכה המאוחדת (בריטניה). היוזמות הללו יצרו כמויות אדירות של נתונים שאינם השוואה בקלות עקב חוסר עקביות הגישות שלהם. מגוון רחב של פרויקטים בינלאומיים כגון האיחוד הבינלאומי Microbiome האנושי, הפרויקט לסטנדרטים Microbiome האנושית בינלאומיים, ואת המכון הלאומי לתקנים וטכנולוגיה (NIST) ניסה להתמודד עם בעיות אלה,14 , ופיתח תקנים עבור מדידות microbiome אשר צריך לאפשר את ההישג של תוצאות אמינות הרבייה. המתוארים כאן הוא פרוטוקול משולב של מספר15,בשימוש רחב16 עבור מטוסי אף-16 rRNA תפוקה גבוהה רצף (16-seq) מתחיל דגימת צואה מקולקציית לצורך הערכה ניתוח נתונים. הפרוטוקול מתאר גישה ללא עמודים PCR, תוכנן במקור עבור חילוץ ישיר של צמח ה-DNA16, כדי לאפשר טיפול בו זמנית מספר גדול של צואה דגימות תוך זמן קצר יחסית עם איכות גבוהה מוגבר DNA עבור ממוקד קביעת רצף של אזור V4 משתנה חיידקים על פלטפורמה משותפת רצף. פרוטוקול זה שמטרתו להדריך מדענים מעוניין ליזום את השימוש מטוסי אף-16 rRNA-אמפליקון רצף בצורה איתנה, הרבייה, קל לשימוש, מפורט, באמצעות פקדי חשוב. יש פרוטוקול שלב מודרכים ומפורט אחר עשוי לצמצם את ההשפעה אצווה, ובכך יאפשר תוצאות דומות יותר רצף בין מעבדות.
Protocol
Representative Results
Discussion
מטוסי אף-16 rRNA-אמפליקון ורצף רובה metagenomics צברו פופולריות ב מיקרוביולוגיה קלינית יישומים21,22,23. טכניקות אלה הן יתרון ביכולת מוגברת שלהם לכידת taxa culturable ו- culturable, המספק נתונים אודות שפע יחסי של inoculum פתוגניים, ואת יכולתם לזהות ביתר דיוק זיהומיות polymicrobial טביעות אצבע…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמך בחלקה על ידי התוכנית-CORE (מעניקה מס 41/11), הקרן הלאומית למדע (גרנט מס 908/15), ואת אירופה קרוהן קוליטיס הארגון (ECCO).
Materials
| Primers | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Extraction solution | Sigma-Aldrich | E7526 | |
| Dilution solution | Sigma-Aldrich | D5688 | |
| Kapa HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit | KAPABIOSYSTEMS | KK2601 | PCR Master mix |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent kit | Invitrogen | P7589 | dsDNA quantify reagent |
| MinElute Gel extraction kit | Qiagen | 28606 | |
| Agarose | Amresco | 0710-250G | |
| Ultra Pure Water Dnase and Rnase Free | Biological Industries | 01-866-1A | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Molecular probes | Q32854 | dsDNA detecting kit |
| High Sensitivity D1000 | Agilent Technologies | Screen Tape 5067-5582 | separation and analysis |
| Screen Tape Assay | Agilent Technologies | Reagents 5067-5583 | for DNA libraries |
| PhiX Control v3 | Illumina | 15017666 | control library |
| MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle) | Illumina | MS-102-2003 | |
| Ethidium Bromide | Amresco | E406-10mL-TAM | |
| 2 mL collection tubes | SARSTEDT | 72.695.400 | Safe Seal collection tubes |
| Plastic stick swab in PP test tube | STERILE INTERIOR | 23117 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| PCR Machine | Applied Biosystems | 2720 Thermal Cycler | |
| Sequncing Machine | Illumina | Miseq | |
| PCR workstation | Biosan | UV-cleaner | |
| scissors | |||
| vortexer | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 |
References
- Braun, T., et al. Fecal microbial characterization of hospitalized patients with suspected infectious diarrhea shows significant dysbiosis. Scientific Reports. 7, 1088 (2017).
- De Filippo, C., et al. Impact of diet in shaping gut microbiota revealed by a comparative study in children from Europe and rural Africa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 14691-14696 (2010).
- Yatsunenko, T., et al. Human gut microbiome viewed across age and geography. Nature. 486, 222-227 (2012).
- Rodriguez, J. M., et al. The composition of the gut microbiota throughout life, with an emphasis on early life. Microbial Ecology in Health and Disease. 26, 26050 (2015).
- Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444, 1027-1031 (2006).
- McDonald, D., et al. An improved Greengenes taxonomy with explicit ranks for ecological and evolutionary analyses of bacteria and archaea. The ISME Journal. 6, 610-618 (2012).
- Bakken, J. S., et al. Treating Clostridium difficile infection with fecal microbiota transplantation. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 9, 1044-1049 (2011).
- Khoruts, A., Dicksved, J., Jansson, J. K., Sadowsky, M. J. Changes in the composition of the human fecal microbiome after bacteriotherapy for recurrent Clostridium difficile-associated diarrhea. Journal of Clinical Gastroenterology. 44, 354-360 (2010).
- Nood, E. V., et al. Duodenal infusion of donor feces for recurrent Clostridium difficile. The New England Journal of Medicine. 368, 407-415 (2013).
- Koplan, J. P., Benfari Ferraro, M. J., Fineberg, H. V., Rosenberg, M. L. Value of stool cultures. The Lancet. 316, 413-416 (1980).
- Platts-Mills, J. A., Liu, J., Houpt, E. R. New concepts in diagnostics for infectious diarrhea. Mucosal Immunology. 6, 876-885 (2013).
- Bokulich, N. A., et al. Quality-filtering vastly improves diversity estimates from Illumina amplicon sequencing. Nature Methods. 10, 57-59 (2013).
- Leek, J. T., et al. Tackling the widespread and critical impact of batch effects in high-throughput data. Nature Reviews Genetics. 11, (2010).
- Dubilier, N., McFall-Ngai, M., Zhao, L. Create a global microbiome effort. Nature. 526, 631-634 (2015).
- Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. PNAS. 108, 4516-4522 (2011).
- Flores, G. E., Henley, J. B., Fierer, N. A direct PCR approach to accelerate analyses of human-associated microbial communities. PloS One. 7, (2012).
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
- Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13, 581-583 (2016).
- Lozupone, C., Knight, R. UniFrac: A new phylogenetic method for comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 71, 8228-8235 (2005).
- Lozupone, C., Lladser, M. E., Knights, D., Stombaugh, J., Knight, R. UniFrac: An effective distance metric for microbial community comparison. The ISME Journal. 5, 169-172 (2011).
- Srinivasan, R., et al. Use of 16S rRNA gene for identification of a broad range of clinically relevant bacterial pathogens. PloS One. 10, e0117617 (2015).
- Hiergeist, A., Gläsner, J., Reischl, U., Gessner, A. Analyses of intestinal microbiota: culture versus sequencing. ILAR Journal. 56, 228-240 (2015).
- Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nature Reviews Genetics. 13, 601-612 (2012).
- Salipante, S. J., et al. Rapid 16S rRNA next-generation sequencing of polymicrobial clinical samples for diagnosis of complex bacterial infections. PloS One. 8, e65226 (2013).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. The ISME Journal. 6, 1621-1624 (2012).
