16S rRNA Amplicon sıralama tarafından dışkı mikrobiyal karakterizasyonu için rehberli iletişim kuralı
Summary
Bu el yazması yüksek üretilen iş 16S rRNA amplicon sıralama, detaylı bir standart protokolünü açıklar. Protokol dışkı örneği koleksiyonu veri analizleri ile başlayarak bir entegre, üniformalı, uygun ve ucuz protokol tanıttı. Bu protokol analiz örnekleri titiz standartları ile çok sayıda ve çeşitli denetimler sağlar.
Abstract
İnsan bağırsak microbiome hücreleri yaralanmalara karşı korumak, enerji ve besin işleme ve dokunulmazlık teşvik merkezi bir rol oynar. Sağlıklı microbiota kompozisyon (dysbiosis) olarak kabul edilir ne gelen sapmalar hayati fonksiyonları için patolojik koşulları önde gelen bozabilen. Son ve devam eden araştırma çabalarının mikrobiyal kompozisyon ve insan sağlığı ve hastalık arasındaki ilişkilendirmeleri karakterizasyonu doğru yönetmen var.
Yüksek işlem hacmi sıralama teknolojileri gelişmeler bağırsak mikrobiyal kompozisyon karakterizasyonu etkinleştirin. Bu yöntemler 16S rRNA amplicon sıralama ve av tüfeği sıralamanın içerir. 16s rRNA amplicon sıralama av tüfeği sıralama gen Öngörüler ve fonksiyonel ek açıklama hakkında ek bilgi sağlarken taxonomical kompozisyon, profil için kullanılır. 16S rRNA gen değişken bölge hedefli sıralama yöntemini kullanarak bir av tüfeği sıralama için karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha düşük maliyet avantajdır. 16S rRNA gen farklılıkları sıra mikrobiyal parmak izi kadar tanımlamak ve farklı özellikleri tek tek bir örnek içinde ölçmek için kullanılır.
Büyük uluslararası çabalara 16S rRNA amplicon sıralama için standartlar kayıtlı. Ancak, çeşitli çalışmalarda ortak bir kaynaktan toplu etkisiyle neden varyasyon bildirin. Bu etki, üniformalı protokolleri için örnek koleksiyonu, en aza indirmek için işleme ve sıralamanın uygulanması gerekir. Bu iletişim kuralı veri analizleri için dışkı örneği koleksiyonundan başlayan genel olarak kullanılan protokolleri entegrasyonu öneriyor. Bu iletişim kuralını eşzamanlı kullanım ve DNA ekstraksiyon dışkı örnekleri, PCR güçlendirme V4 bölgesinin yanı sıra çok sayıda sağlar sütun-Alerjik, doğrudan-PCR yaklaşım içerir. Ayrıca, protokol analiz boru hattı açıklar ve QIIME (QIIME 2 yorum 2017.7.0 ve DADA2) en son sürümünü kullanarak bir komut dosyası sağlar. Adım adım bu protokolü ilgilenenler sağlam, üreme, kullanımı kolay ve ayrıntılı bir şekilde 16S rRNA amplicon sıralaması kullanımına başlatılıyor rehberlik etmek hedefleniyor.
Introduction
Yoğun çabaları microbiome çeşitlilik ve bolluk, fark ve sağlıklı ve patolojik koşullarda bireyler arasındaki benzerlikler yakalamak bir diğer yönü olarak daha iyi anlamak için yapılmıştır. Yaş2,3, coğrafi konum4, yaşam tarzı5,6ve hastalık5 gut microbiome kompozisyon ile ilişkili olduğu gösterilmiştir, ancak birçok koşul ve nüfus henüz tam olarak henüz karakterize. Son zamanlarda microbiome için tedavi uygulamaları7,8,9değiştirilebilir bildirilmiştir. Bu nedenle, çeşitli fizyolojik şartlarda ve mikrobiyal kompozisyon ilişkisi içine ek fikir potansiyel gelecek değişiklikler duruma getirilmesi doğru ilk adımdır.
Geleneksel mikrobiyal kültür yöntemleri düşük verimleri10,11tarafından sınırlı olduğunu ve ikili bir devlet ya da nerede bir bakteri kavramsallaştırma gut ya da mevcut. Yüksek işlem hacmi DNA tabanlı sıralama mikrobiyal ekoloji, mikrobiyal toplumun tüm üyelerinin yakalama etkinleştirme devrim yarattı. Ancak, sıra uzunluğu ve kalite önemli engelleri doğru taksonomi atama12kalır okuyun. Ayrıca, yüksek üretilen iş tabanlı deneyler nerede ölçümleri biyolojik olmayan veya bilimsel olmayan değişkenler13tarafından etkilenen toplu etkileri muzdarip olabilir. Son yıllarda, çeşitli programlar insan microbiome Amerikan Gut proje, Amerika Birleşik Devletleri (ABD) insan Microbiome projesi ve Birleşik Krallık (UK) MetaHIT projesi de dahil olmak üzere, eğitim için kurulmuştur. Bu girişimler tutarlılık onların yaklaşımlar eksikliği nedeniyle kolayca karşılaştırılabilir değildir verileri oluşturmuş. Bazı bu sorunları14 yönelik olarak uluslararası insan Microbiome Konsorsiyumu, uluslararası insan Microbiome Standartları Projesi ve National Institute of Standards ve Technology (NIST) gibi uluslararası projeler çeşitli çalıştı ve geliştirilen güvenilir üreme sonuçlar ulaşılmasına izin vermesi gerekir microbiome ölçümleri için standartları. Burada açıklanan 16S rRNA yüksek üretilen iş (16S-seq) sıralama veri analizleri aracılığıyla dışkı örneği koleksiyonundan başlatmak için birkaç genel olarak kullanılan yöntemlerin15,16 entegre bir protokoldür. Bitki DNA16doğrudan çıkarma için tasarlanan bir sütun ücretsiz PCR yaklaşım, protokolünü açıklar, dışkı çok sayıda eşzamanlı işlemeyi etkinleştirmek IÇIN örnekleri nispeten kısa sürede yüksek kalitede DNA hedef için güçlendirilmiş mikrobiyal değişken V4 bölgenin ortak bir sıralama platformu üzerinde sıralanıyor. Bu iletişim kuralı bilim adamları sağlam, üreme, kullanımı kolay, detaylı bir şekilde 16S rRNA amplicon sıralaması kullanımına başlatılıyor baktılar önemli denetimlerini kullanma kılavuzu amaçlamaktadır. Bir rehber eşliğinde ve detaylı adım-tarafından adım protokolü olan toplu etkisini en aza indirmek ve böylece daha karşılaştırılabilir sıralama sonuçları labs arasında izin verir.
Protocol
Representative Results
Discussion
16s rRNA-amplicon ve metagenomics av tüfeği sıralamanın Klinik Mikrobiyoloji uygulamaları21,22,23popülerlik kazanmıştır. Bu teknikler artan yeteneklerini patojen inoculum ve yeteneklerini daha doğrusu bir polymicrobial bulaşıcı belirlemek için göreli bolluk hakkında veri sağlayan culturable ve culturable takson yakalamak için avantajlı olan 24parmak izi. Microbiome araştırma alanında gelişmeler çeşitli yaklaşımla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser kısmen (No 41/11 verir)-CORE programı, İsrail Bilim Vakfı (grant No 908/15), Avrupa Crohn ve kolit organizasyon (ECCO) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Primers | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Extraction solution | Sigma-Aldrich | E7526 | |
| Dilution solution | Sigma-Aldrich | D5688 | |
| Kapa HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit | KAPABIOSYSTEMS | KK2601 | PCR Master mix |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent kit | Invitrogen | P7589 | dsDNA quantify reagent |
| MinElute Gel extraction kit | Qiagen | 28606 | |
| Agarose | Amresco | 0710-250G | |
| Ultra Pure Water Dnase and Rnase Free | Biological Industries | 01-866-1A | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Molecular probes | Q32854 | dsDNA detecting kit |
| High Sensitivity D1000 | Agilent Technologies | Screen Tape 5067-5582 | separation and analysis |
| Screen Tape Assay | Agilent Technologies | Reagents 5067-5583 | for DNA libraries |
| PhiX Control v3 | Illumina | 15017666 | control library |
| MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle) | Illumina | MS-102-2003 | |
| Ethidium Bromide | Amresco | E406-10mL-TAM | |
| 2 mL collection tubes | SARSTEDT | 72.695.400 | Safe Seal collection tubes |
| Plastic stick swab in PP test tube | STERILE INTERIOR | 23117 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| PCR Machine | Applied Biosystems | 2720 Thermal Cycler | |
| Sequncing Machine | Illumina | Miseq | |
| PCR workstation | Biosan | UV-cleaner | |
| scissors | |||
| vortexer | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 |
References
- Braun, T., et al. Fecal microbial characterization of hospitalized patients with suspected infectious diarrhea shows significant dysbiosis. Scientific Reports. 7, 1088 (2017).
- De Filippo, C., et al. Impact of diet in shaping gut microbiota revealed by a comparative study in children from Europe and rural Africa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 14691-14696 (2010).
- Yatsunenko, T., et al. Human gut microbiome viewed across age and geography. Nature. 486, 222-227 (2012).
- Rodriguez, J. M., et al. The composition of the gut microbiota throughout life, with an emphasis on early life. Microbial Ecology in Health and Disease. 26, 26050 (2015).
- Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444, 1027-1031 (2006).
- McDonald, D., et al. An improved Greengenes taxonomy with explicit ranks for ecological and evolutionary analyses of bacteria and archaea. The ISME Journal. 6, 610-618 (2012).
- Bakken, J. S., et al. Treating Clostridium difficile infection with fecal microbiota transplantation. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 9, 1044-1049 (2011).
- Khoruts, A., Dicksved, J., Jansson, J. K., Sadowsky, M. J. Changes in the composition of the human fecal microbiome after bacteriotherapy for recurrent Clostridium difficile-associated diarrhea. Journal of Clinical Gastroenterology. 44, 354-360 (2010).
- Nood, E. V., et al. Duodenal infusion of donor feces for recurrent Clostridium difficile. The New England Journal of Medicine. 368, 407-415 (2013).
- Koplan, J. P., Benfari Ferraro, M. J., Fineberg, H. V., Rosenberg, M. L. Value of stool cultures. The Lancet. 316, 413-416 (1980).
- Platts-Mills, J. A., Liu, J., Houpt, E. R. New concepts in diagnostics for infectious diarrhea. Mucosal Immunology. 6, 876-885 (2013).
- Bokulich, N. A., et al. Quality-filtering vastly improves diversity estimates from Illumina amplicon sequencing. Nature Methods. 10, 57-59 (2013).
- Leek, J. T., et al. Tackling the widespread and critical impact of batch effects in high-throughput data. Nature Reviews Genetics. 11, (2010).
- Dubilier, N., McFall-Ngai, M., Zhao, L. Create a global microbiome effort. Nature. 526, 631-634 (2015).
- Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. PNAS. 108, 4516-4522 (2011).
- Flores, G. E., Henley, J. B., Fierer, N. A direct PCR approach to accelerate analyses of human-associated microbial communities. PloS One. 7, (2012).
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
- Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13, 581-583 (2016).
- Lozupone, C., Knight, R. UniFrac: A new phylogenetic method for comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 71, 8228-8235 (2005).
- Lozupone, C., Lladser, M. E., Knights, D., Stombaugh, J., Knight, R. UniFrac: An effective distance metric for microbial community comparison. The ISME Journal. 5, 169-172 (2011).
- Srinivasan, R., et al. Use of 16S rRNA gene for identification of a broad range of clinically relevant bacterial pathogens. PloS One. 10, e0117617 (2015).
- Hiergeist, A., Gläsner, J., Reischl, U., Gessner, A. Analyses of intestinal microbiota: culture versus sequencing. ILAR Journal. 56, 228-240 (2015).
- Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nature Reviews Genetics. 13, 601-612 (2012).
- Salipante, S. J., et al. Rapid 16S rRNA next-generation sequencing of polymicrobial clinical samples for diagnosis of complex bacterial infections. PloS One. 8, e65226 (2013).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. The ISME Journal. 6, 1621-1624 (2012).
