Protocolo guiado para caracterização microbiana Fecal de 16S rRNA-Amplicon sequenciação
Summary
Este manuscrito descreve um protocolo padronizado detalhado de arranjar em sequência do elevado-throughput 16S rRNA-amplicon. O protocolo apresenta um protocolo integrado, uniformizado, viável e barato a partir de coleta de amostra fecal através de análises de dados. Este protocolo permite a análise de um grande número de amostras com padrões rigorosos e vários controles.
Abstract
A humana microbiome intestinal desempenha um papel central em proteger as células de uma lesão, no processamento de energia e nutrientes e na promoção da imunidade. Desvios do que é considerado uma composição da microbiota saudável (disbiose) podem prejudicar as funções vitais levando a condições patológicas. Esforços recentes e em curso de investigação tem sido direcionados para a caracterização das associações entre composição microbiana e a saúde humana e a doença.
Avanços em tecnologias de sequenciamento do elevado-throughput permitem a caracterização a composição microbiana do intestino. Estes métodos incluem 16S rRNA-amplicon sequenciamento e sequenciamento de espingarda. 16s rRNA-amplicon sequenciamento é usado para perfil composição taxonômica, enquanto o sequenciamento de espingarda fornece informações adicionais sobre as previsões de gene e anotação funcional. Uma vantagem em usar um método de sequenciamento alvo da região variável do gene de rRNA 16S é seu custo substancialmente menor comparado ao sequenciamento de espingarda. Diferenças de sequência no gene 16S rRNA são usadas como uma impressão digital microbiana para identificar e quantificar diferentes táxons dentro de uma amostra individual.
Grandes esforços internacionais tem alistado padrões para 16S rRNA-amplicon sequenciamento. No entanto, vários estudos relatam uma fonte comum de variação causada pelo efeito do lote. Para minimizar esse efeito, protocolos uniformizados para colheita de amostras, processamento e sequenciamento devem ser implementado. Este protocolo propõe a integração de protocolos amplamente usados a partir de coleta de amostra fecal para análises de dados. Este protocolo inclui uma abordagem direta-PCR coluna-livre, que permite a manipulação simultânea e extração de DNA de um grande número de amostras fecais, juntamente com a amplificação por PCR da região V4. Além disso, o protocolo descreve o pipeline de análise e fornece um script usando a versão mais recente do QIIME (QIIME 2 versão 2017.7.0 e DADA2). Este protocolo passo a passo é destinado a orientar os interessados em iniciar o uso do 16S rRNA-amplicon sequenciamento de forma robusta, reprodutiva, fácil de usar, detalhada.
Introduction
Esforços concentrados foram feitos para entender melhor microbiome diversidade e abundância, como outro aspecto de captar a diferença e semelhanças entre os indivíduos em condições saudáveis e patológicos. Idade2,3, geografia4, estilo de vida5,6e doença5 foram mostrados para ser associado com a composição de microbiome o intestino, mas muitas condições e populações ainda não foram totalmente caracteriza-se. Recentemente foi relatado que o microbiome pode ser modificado para aplicações terapêuticas7,8,9. Portanto, insights adicionais sobre a relação entre várias condições fisiológicas e a composição microbiana é o primeiro passo para a otimização dos potenciais futuras modificações.
Os métodos tradicionais de cultura microbiana são limitados por baixos rendimentos de10,11e são conceitualizados como um estado binário, onde uma bactéria está presente no intestino, ou não. Sequenciamento de alto rendimento baseado em DNA revolucionou a ecologia microbiana, permitindo a captura de todos os membros da comunidade microbiana. No entanto, a sequência ler comprimento e qualidade permanecem entraves significativos à taxonomia exata atribuição12. Além disso, experimentos com base alta produtividade podem sofrer de efeitos em lote, onde as medições são afetadas por variáveis não-biológicos ou não-científica13. Nos últimos anos, vários programas foram estabelecidos para estudar a microbiome humano, incluindo o projeto americano Gut, o projeto de Microbiome humano dos Estados Unidos (EUA) e o projeto MetaHIT do Reino Unido (UK). Estas iniciativas têm gerado grandes quantidades de dados que não são facilmente comparáveis devido à falta de consistência em suas abordagens. Uma variedade de projetos internacionais como o consórcio internacional de Microbiome humano, o projeto humana Microbiome as normas internacionais e o National Institute of Standards e tecnologia (NIST) tentou abordar algumas dessas questões14 e desenvolveu padrões para medições de microbiome que deverá permitir a obtenção de resultados reprodutivos confiáveis. Aqui descrito é um protocolo integrado de vários métodos amplamente utilizados15,16 para 16S rRNA elevado-throughput sequenciamento (16S-seq) a partir de coleta de amostra fecal através de análises de dados. O protocolo descreve uma abordagem PCR coluna-livre, projetada originalmente para extração direta de planta DNA16, para habilitar a manipulação simultânea de um grande número de fecal amostras em um tempo relativamente curto com alta qualidade amplificado DNA para alvo sequenciamento da região de V4 microbiana da variável sobre uma plataforma comum de sequenciamento. Este protocolo visa orientar cientistas interessados em iniciar o uso do 16S rRNA-amplicon sequenciamento de forma robusta, reprodutiva, fácil de usar, detalhada, usando controles importantes. Tendo um protocolo guiada e detalhadas passo-a-passo pode minimizar o efeito de lote e assim permitirá resultados de sequenciamento mais comparáveis entre laboratórios.
Protocol
Representative Results
Discussion
16s rRNA-amplicon e sequenciamento de espingarda metagenomics ganharam popularidade em aplicações de Microbiologia clínica21,22,23. Estas técnicas são vantajosas em sua capacidade aumentada para capturar táxons viáveis e não viáveis, fornecendo dados sobre a abundância relativa de inóculo patogênico e sua capacidade de identificar mais precisamente um polymicrobial infecciosa impressão digital24. Os avanços no campo da pesqui…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado em parte pelo programa-CORE (subvenções n º 41/11), a Israel Science Foundation (grant no. 908/15) e o Europeu de Crohn e colite organização (ECCO).
Materials
| Primers | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Extraction solution | Sigma-Aldrich | E7526 | |
| Dilution solution | Sigma-Aldrich | D5688 | |
| Kapa HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit | KAPABIOSYSTEMS | KK2601 | PCR Master mix |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent kit | Invitrogen | P7589 | dsDNA quantify reagent |
| MinElute Gel extraction kit | Qiagen | 28606 | |
| Agarose | Amresco | 0710-250G | |
| Ultra Pure Water Dnase and Rnase Free | Biological Industries | 01-866-1A | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Molecular probes | Q32854 | dsDNA detecting kit |
| High Sensitivity D1000 | Agilent Technologies | Screen Tape 5067-5582 | separation and analysis |
| Screen Tape Assay | Agilent Technologies | Reagents 5067-5583 | for DNA libraries |
| PhiX Control v3 | Illumina | 15017666 | control library |
| MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle) | Illumina | MS-102-2003 | |
| Ethidium Bromide | Amresco | E406-10mL-TAM | |
| 2 mL collection tubes | SARSTEDT | 72.695.400 | Safe Seal collection tubes |
| Plastic stick swab in PP test tube | STERILE INTERIOR | 23117 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| PCR Machine | Applied Biosystems | 2720 Thermal Cycler | |
| Sequncing Machine | Illumina | Miseq | |
| PCR workstation | Biosan | UV-cleaner | |
| scissors | |||
| vortexer | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 |
References
- Braun, T., et al. Fecal microbial characterization of hospitalized patients with suspected infectious diarrhea shows significant dysbiosis. Scientific Reports. 7, 1088 (2017).
- De Filippo, C., et al. Impact of diet in shaping gut microbiota revealed by a comparative study in children from Europe and rural Africa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 14691-14696 (2010).
- Yatsunenko, T., et al. Human gut microbiome viewed across age and geography. Nature. 486, 222-227 (2012).
- Rodriguez, J. M., et al. The composition of the gut microbiota throughout life, with an emphasis on early life. Microbial Ecology in Health and Disease. 26, 26050 (2015).
- Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444, 1027-1031 (2006).
- McDonald, D., et al. An improved Greengenes taxonomy with explicit ranks for ecological and evolutionary analyses of bacteria and archaea. The ISME Journal. 6, 610-618 (2012).
- Bakken, J. S., et al. Treating Clostridium difficile infection with fecal microbiota transplantation. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 9, 1044-1049 (2011).
- Khoruts, A., Dicksved, J., Jansson, J. K., Sadowsky, M. J. Changes in the composition of the human fecal microbiome after bacteriotherapy for recurrent Clostridium difficile-associated diarrhea. Journal of Clinical Gastroenterology. 44, 354-360 (2010).
- Nood, E. V., et al. Duodenal infusion of donor feces for recurrent Clostridium difficile. The New England Journal of Medicine. 368, 407-415 (2013).
- Koplan, J. P., Benfari Ferraro, M. J., Fineberg, H. V., Rosenberg, M. L. Value of stool cultures. The Lancet. 316, 413-416 (1980).
- Platts-Mills, J. A., Liu, J., Houpt, E. R. New concepts in diagnostics for infectious diarrhea. Mucosal Immunology. 6, 876-885 (2013).
- Bokulich, N. A., et al. Quality-filtering vastly improves diversity estimates from Illumina amplicon sequencing. Nature Methods. 10, 57-59 (2013).
- Leek, J. T., et al. Tackling the widespread and critical impact of batch effects in high-throughput data. Nature Reviews Genetics. 11, (2010).
- Dubilier, N., McFall-Ngai, M., Zhao, L. Create a global microbiome effort. Nature. 526, 631-634 (2015).
- Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. PNAS. 108, 4516-4522 (2011).
- Flores, G. E., Henley, J. B., Fierer, N. A direct PCR approach to accelerate analyses of human-associated microbial communities. PloS One. 7, (2012).
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
- Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13, 581-583 (2016).
- Lozupone, C., Knight, R. UniFrac: A new phylogenetic method for comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 71, 8228-8235 (2005).
- Lozupone, C., Lladser, M. E., Knights, D., Stombaugh, J., Knight, R. UniFrac: An effective distance metric for microbial community comparison. The ISME Journal. 5, 169-172 (2011).
- Srinivasan, R., et al. Use of 16S rRNA gene for identification of a broad range of clinically relevant bacterial pathogens. PloS One. 10, e0117617 (2015).
- Hiergeist, A., Gläsner, J., Reischl, U., Gessner, A. Analyses of intestinal microbiota: culture versus sequencing. ILAR Journal. 56, 228-240 (2015).
- Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nature Reviews Genetics. 13, 601-612 (2012).
- Salipante, S. J., et al. Rapid 16S rRNA next-generation sequencing of polymicrobial clinical samples for diagnosis of complex bacterial infections. PloS One. 8, e65226 (2013).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. The ISME Journal. 6, 1621-1624 (2012).
