Dichte Gradienten Ultrazentrifugation
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Overview
Dichte Gradienten Ultrazentrifugation ist eine verbreitete Methode, zu isolieren und reinigen von Biomolekülen und Zelle Strukturen. Diese Technik nutzt die Tatsache, dass in der Schwebe, Partikel, die Dichter als das Lösungsmittel Sediment, werden während diejenigen, die weniger Dichte schwimmt. Ein High-Speed-Ultrazentrifuge wird verwendet, um diesen Prozess zu beschleunigen um Biomoleküle innerhalb ein Dichtegradient trennen, die durch Überlagerung von Flüssigkeiten abnehmender Dichte in einem Zentrifugenröhrchen begründet werden kann.
Das Video deckt die Grundsätze der Dichte Gradienten Ultrazentrifugation, einschließlich eines Verfahrens, das Probenvorbereitung, Schaffung einer Saccharose Farbverlauf, Ultrazentrifugation und Sammlung von fraktionierten Analyten veranschaulicht. Der Anwendungsabschnitt erläutert Isolierung von Multi-Protein-komplexe, Isolierung von Nukleinsäure-komplexe und Trennung mit Cäsium-Chlorid Dichtegradienten.
Dichte Gradienten Ultrazentrifugation ist ein gemeinsamer Ansatz zu isolieren und Zellstrukturen für biochemische Experimente zu reinigen. Die Technik nutzt eine High-Speed- oder ultra, Zentrifuge, um zelluläre Komponenten in ein Dichtegradient zerstörungsfrei zu trennen. Dieses Video beschreibt die Prinzipien der Dichte Gradienten Ultrazentrifugation, bietet ein allgemeines Verfahren mit einem Farbverlauf von Saccharose und bespricht einige Anwendungen.
Anhand der Grundsätze der Ultrazentrifugation und Dichtegradienten beginnen. Eine Suspension enthält Teilchen in einem flüssigen Lösungsmittel. Aufgrund der Schwerkraft heraus Partikel Dichter als das Lösungsmittel Sediment während diejenigen, die weniger dicht als der Lösungsmittel Schwimmer. Je größer die Differenz in der Dichte zwischen Partikel und das Lösungsmittel, desto schneller die Trennung.
Eine Ultrazentrifuge enthält eine Einheit mit dem Namen eines Rotors, der mit sehr kontrollierter Geschwindigkeit dreht, einem starken Gravitationsfeld zu simulieren. In diesem Bereich sind die Unterschiede in der Dichte zwischen Teilchen und dem Lösungsmittel vergrößert.
Die Stärke des Feldes hängt von der Geschwindigkeit der Rotation. Sogar ein kleinen Rotor bei relativ niedriger Drehzahl erzeugen eine Kraft Tausende Male stärker als Schwerefeld der Erde.
Wenn ein Rohr mehrere Flüssigkeiten unterschiedlicher Dichte enthält, halten Zentrifugation sie in separaten Schichten in der Reihenfolge der Dichte, mit der dichtesten Flüssigkeit am nächsten an der Basis. Solch eine Schichtung von mehreren Flüssigkeiten nennt man eine “Dichtegradient.” Es gibt zwei Arten. In Schritt Steigungen, abnehmender Dichte von Flüssigkeiten werden sorgfältig an der Spitze aufeinander geschichtet. In kontinuierliche Farbverläufe werden die Flüssigkeiten in unterschiedlichen Anteilen gemischt, so die Dichte reibungslos von der Basis nach oben abnimmt.
Zellulare Organellen können getrennt werden, mit einem Schritt Farbverlauf durch “Isopycnic Dichtegradienten Zentrifugation.” Dies ist die einfachste und häufigste Zentrifugation Verfahren.
Dieses Verfahren wird verwendet, um die Zellstrukturen zu trennen. Der Dichter die Organellen, je weiter es steigt-mit Mitochondrien an der Spitze und Nukleinsäuren in Richtung zur Unterseite.
Nun, da Sie die Prinzipien hinter der Technik kennen, schauen wir es im Labor.
Vor Beginn des Verfahrens des Herstellers Geschwindigkeit und Dichte Bewertungen sollte beachtet werden, und der Ultrazentrifuge auf Korrosion überprüft. Dieses Verfahren nutzt einen schwingen-Eimer-Rotor.
Erstens ist das Zellmaterial vorbereitet durch Homogenisierung der Zellen, die releases zerstörungsfrei ihre Organellen. Das Homogenat kann durch vorläufige Lowspeed Zentrifugation, Low-Density-Komponenten entfernen fraktioniert werden. Als nächstes sind die Saccharose-Lösungen bereit.
Saccharose wird in steigenden Mengen, so ist jede Lösung stärker konzentriert und daher Dichter, als die vorhergehende hinzugefügt. Die genaue Dichte der Lösungen hängt die Komponenten getrennt werden, die zwischen Organismen variieren. Die Lösungen sollten Dichte zwischen den Komponenten, die mit der letzten Lösung Dichter als die dichteste Komponente des Analyten getrennt werden müssen. Techniken zur Trennung von Komponenten Dichter als Saccharose, wie Nukleinsäuren, sind in den Anwendungen beschrieben.
Die Saccharose-Gradient wird nun in einem sauberen Zentrifugenröhrchen erstellt. Eine Pipette wird verwendet, um die am höchsten konzentrierte Saccharoselösung erarbeiten. Mit dem Rohr aufrecht die Pipettenspitze ist hoch an der Wand platziert, und die Flüssigkeit verzichtet stetig nach unten. Es ist wichtig, dass der Arbeitsbereich frei von Vibrationen und andere Störungen bleibt.
Nach dem Austausch der Spitze, werden die restlichen Lösungen in der Reihenfolge abnehmender Dichte hinzugefügt. Die Abgabe erfolgt sorgfältig um unterschiedliche Schichten zu bilden und zu vermeiden, mischen. Schließlich etwa einen halben Milliliter der zellularen Probe wird oben auf den Farbverlauf hinzugefügt, und das Rohr wird gewogen. Dies dient zum Abgleich der Gewichtsverteilung, der nächste Schritt des Prozesses.
Zentrifugation sollten so bald wie möglich beginnen. Das Rohr wird in den Rotor, die dann ausgeglichen wird, indem man leere Lösungen von gleichem Gewicht in die Schlitze gegensätzlichen gesetzt. Der Rotor befindet sich in der Ultrazentrifuge und das System versiegelt. Die Temperatur und Rotationsgeschwindigkeit und Uhrzeit sind eingestellt. Typische Werte sind 4 ° C mit einer Kraft von mehr als 100.000 x g für 16 h.
Nach Zentrifugation, das Rohr ist zurückgezogen vom Rotor, kümmert sich um sie aufrecht und ungestört bleibt. Die verschiedenen zellulären Komponenten haben in diskreten Bänder zwischen den Schichten der Lösung fraktioniert. Die Fraktionen können mit einer Spritze gesammelt werden. Abwechselnd, der Boden des Röhrchens kann mit einer feinen, sterilisierten Nadel punktiert und der Abfluss in sterilen Röhrchen gesammelt. Die zellulären Komponenten haben jetzt isoliert worden. Sie können bei-80 ° c gelagert werden
Nun, da wir die grundlegende Vorgehensweise gesehen haben, betrachten Sie einige Anwendungen.
Eine typische Anwendung ist die Isolierung der Multi-Protein-komplexe in pflanzlichen Zellen. In diesem Beispiel werden komplexe zyklischer Elektronenfluss verantwortet von der Thylakoidmembran, die Stelle der Licht-Reaktion bei der Photosynthese isoliert werden. Dieses Verfahren nutzt diskrete Lösungen von 14 bis 45 % Saccharose. Zentrifugation tritt mehr als 100.000 x g 14 h bei 4 ° C.
Da Nukleinsäuren Dichter als Saccharose sind, kann nicht Isopycnic Zentrifugieren sie von Organellen zerstörungsfrei zu trennen.
Eine andere Technik, bekannt als “Rate-zonale Zentrifugation” verwendet wird. Es trennt Organellen, die basierend auf ihrer Sedimentationsraten, die nicht nur auf ihre dichten, sondern auch auf ihre Konformationen abhängen. Eine kontinuierliche Steigung wird verwendet, um die Komponenten, die auf Grundlage dieser Eigenschaft zu trennen.
Die Verfahrensschritte sind ähnlich wie bei Isopycnic Fällen. In diesem Beispiel RNA-Ribosom-komplexe sind isoliert mit einer kontinuierlichen Steigung von 5 % bis 20 %, bei 230.000 x g. Zentrifugation zentrifugiert wird unterbrochen, nach ein paar Stunden Co Niederschlag zu verhindern.
Nukleinsäure-Stränge können auf der Grundlage der Dichte voneinander getrennt werden.
Dies ist da Stränge reich an Guanin und Cytosin Dichter als diese reich an Adenin und Thiamin sind. In diesem Fall kann nicht die Steigung von Saccharose, gemacht werden, weil Saccharose weniger dicht als Nukleinsäuren ist. Stattdessen werden Cäsium-Chlorid Steigungen, in der Regel von 1,65 bis 1,75 g/mL verwendet, da sie ausreichend Dichte und eine niedrige Viskosität haben.
Hier sehen wir Plankton DNA, geläutert, mit einem kontinuierlichen Cäsium Chlorid Farbverlauf. Zentrifugation tritt bei mehr als 1.000.000 x g für 18 h unter Vakuum.
Sie haben nur Jupiters Video auf Ultrazentrifugation mit einer Saccharose Dichtegradient angesehen. Sie sollten jetzt verstehen, wie ein Dichtegradient funktioniert, wie man einen Farbverlauf Schritt konstruieren und zum Laden und betreiben einer Ultrazentrifuge. Danke fürs Zuschauen!
Procedure
Disclosures
Transcript
Density gradient ultracentrifugation is a common approach to isolate and purify cell structures for biochemical experiments. The technique uses a high-speed, or ultra, centrifuge to nondestructively separate cellular components in a density gradient. This video describes the principles of density gradient ultracentrifugation, provides a general procedure using a sucrose gradient, and discusses some applications.
Let’s start by examining the principles of ultracentrifuges and density gradients. A suspension contains particles in a liquid solvent. Because of gravity, particles denser than the solvent sediment out while those less dense than the solvent float. The greater the difference in density between the particle and the solvent, the faster the separation.
An ultracentrifuge contains a unit called a rotor, which rotates at highly controlled speeds, simulating a strong gravitational field. Within this field, the differences in density between particles and the solvent are magnified.
The strength of the field depends on the speed of rotation. Even a small rotor at a relatively low rotational speed can create a force thousands of times stronger than the earth’s gravitational field.
If a tube contains several liquids of different densities, centrifugation will keep them in separate layers in order of density, with the densest liquid closest to the base. Such a layering of multiple liquids is called a “density gradient.” There are two types. In step gradients, liquids of decreasing density are carefully layered on top one another. In continuous gradients, the liquids are mixed in varying proportions, so the density decreases smoothly from the base upwards.
Cellular organelles can be separated using a step gradient, through “isopycnic density-gradient centrifugation.” This is the simplest and most common centrifugation procedure.
This procedure is used to separate the cellular structures. The more dense the organelle, the further it descends-with mitochondria at the top and nucleic acids towards the bottom.
Now that you know the principles behind the technique, let’s see it in the lab.
Before the procedure is started, the manufacturer’s speed and density ratings should be noted, and the ultracentrifuge checked for corrosion. This procedure uses a swinging-bucket rotor.
First, the cellular material is prepared by homogenizing the cells, which nondestructively releases their organelles. The homogenate may be fractionated through preliminary low-speed centrifugation, to remove low-density components. Next, the sucrose solutions are prepared.
Sucrose is added in increasing amounts so each solution is more concentrated, and therefore denser, than the preceding one. The exact densities of the solutions will depend on the components to be separated, which vary between organisms. The solutions should have densities between those of the components to be separated, with the last solution denser than the densest component of the analyte. Techniques for separating components denser than sucrose, like nucleic acids, are described in the applications.
The sucrose gradient is now created in a clean centrifuge tube. A pipette is used to draw up the most concentrated sucrose solution. With the tube held upright, the pipette tip is placed high against the wall, and the liquid dispensed steadily down. It’s important that the working area is kept free of vibrations and other disturbances.
After replacing the tip, the remaining solutions are added in order of decreasing density. They are dispensed carefully to form distinct layers and avoid mixing. Finally, about half a milliliter of the cellular sample is added atop the gradient, and the tube is weighed. This is used to balance the weight distribution, the next step of the process.
Centrifugation should begin as soon as possible. The tube is placed in the rotor, which is then balanced by placing blank solutions of equal weight in opposing slots. The rotor is placed in the ultracentrifuge and the system sealed. The temperature and rotation speed and time are set. Typical values are 4 °C with a force of over 100,000 x g for 16 h.
After centrifugation, the tube is withdrawn from the rotor, taking care to keep it upright and undisturbed. The different cellular components have fractionated into discrete bands between the solution layers. The fractions can be collected with a syringe. Alternately, the bottom of the tube can be punctured with a fine, sterilized needle and the outflow collected in sterile tubes. The cellular components have now been isolated. They can be stored at -80 °C.
Now that we’ve seen the basic procedure, let’s look at some applications.
A typical application is the isolation of multi-protein complexes in plant cells. In this example, complexes responsible for cyclic electron flow are being isolated from the thylakoid, the site of the light reaction in photosynthesis. This procedure uses discrete solutions of 14 to 45% sucrose. Centrifugation occurs over 100,000 x g for 14 h at 4 °C.
Because nucleic acids are denser than sucrose, isopycnic centrifugation cannot separate them from organelles nondestructively.
A different technique, known as “rate-zonal centrifugation” is used. It separates organelles based on their sedimentation rates, which depend not only on their densities, but also on their conformations. A continuous gradient is used to separate the components based on this property.
The procedural steps are similar to those for isopycnic cases. In this example, RNA-ribosome complexes are isolated using a continuous gradient of 5% to 20%, centrifuged at 230,000 x g. Centrifugation is interrupted after a few hours to prevent co-precipitation.
Nucleic acid strands can be separated from each other on the basis of density.
This is because strands rich in guanine and cytosine are denser than those rich in adenine and thiamine. In this case, the gradient cannot be made of sucrose, because sucrose is less dense than nucleic acids. Instead, cesium chloride gradients, typically from 1.65 to 1.75 g/mL are used, as they have sufficient density and a low viscosity.
Here we see plankton DNA being purified using a continuous cesium chloride gradient. Centrifugation occurs at over 1,000,000 x g for 18 h under vacuum.
You’ve just watched JoVE’s video on ultracentrifugation with a sucrose density gradient. You should now understand how a density gradient works, how to construct a step gradient, and how to load and operate an ultracentrifuge. Thanks for watching!
