Ultracentrifugação por Gradiente de Densidade
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Overview
A ultracentrifugação gradiente de densidade é uma técnica comum usada para isolar e purificar biomoléculas e estruturas celulares. Esta técnica explora o fato de que, em suspensão, partículas mais densas do que o solvente irão sedimentar, enquanto aquelas que são menos densas flutuarão. Uma ultracentragem de alta velocidade é usada para acelerar esse processo, a fim de separar biomoléculas dentro de um gradiente de densidade, que pode ser estabelecido por camadas de líquidos de densidade decrescente em um tubo de centrífuga.
O vídeo abordará os princípios da ultracentrifugação de gradiente de densidade, incluindo um procedimento que demonstra a preparação da amostra, a criação de um gradiente de sacarose, ultracentrifugação e coleta de analitos fracionados. A seção de aplicações discute o isolamento de complexos multi-proteínas, o isolamento de complexos ácidas nucleicos e a separação usando gradientes de densidade de cloreto de césio.
A ultracentrifugação de gradiente de densidade é uma abordagem comum para isolar e purificar estruturas celulares para experimentos bioquímicos. A técnica usa uma centrífuga de alta velocidade, ou ultra, para separar componentes celulares não destrutivos em um gradiente de densidade. Este vídeo descreve os princípios da ultracentrifugação de gradiente de densidade, fornece um procedimento geral usando um gradiente de sacarose e discute algumas aplicações.
Vamos começar examinando os princípios dos ultracentrificos e gradientes de densidade. Uma suspensão contém partículas em um solvente líquido. Por causa da gravidade, partículas mais densas que o sedimento solvente fora enquanto aqueles menos densos do que o solvente flutuam. Quanto maior a diferença de densidade entre a partícula e o solvente, mais rápida será a separação.
Uma ultracentragem contém uma unidade chamada rotor, que gira a velocidades altamente controladas, simulando um forte campo gravitacional. Dentro deste campo, as diferenças de densidade entre partículas e solvente são ampliadas.
A força do campo depende da velocidade de rotação. Mesmo um pequeno rotor a uma velocidade rotacional relativamente baixa pode criar uma força milhares de vezes mais forte que o campo gravitacional da Terra.
Se um tubo contiver vários líquidos de diferentes densidades, a centrifugação os manterá em camadas separadas por ordem de densidade, com o líquido mais denso mais próximo da base. Tal camada de múltiplos líquidos é chamado de “gradiente de densidade”. Há dois tipos. Em gradientes de passo, líquidos de densidade decrescente são cuidadosamente em camadas em cima uns dos outros. Em gradientes contínuos, os líquidos são misturados em proporções variadas, de modo que a densidade diminui suavemente da base para cima.
Organelas celulares podem ser separadas usando um gradiente de passo, através de “centrifugação de densidade isócnica-gradiente”. Este é o procedimento de centrifugação mais simples e comum.
Este procedimento é usado para separar as estruturas celulares. Quanto mais densa a organela, mais ela desce com mitocôndrias no topo e ácidos nucleicos em direção ao fundo.
Agora que você sabe os princípios por trás da técnica, vamos vê-la no laboratório.
Antes do procedimento ser iniciado, devem ser anotadas as classificações de velocidade e densidade do fabricante, e a ultracentrúruga verificada para corrosão. Este procedimento usa um rotor de balde de balanço.
Primeiro, o material celular é preparado pela homogeneização das células, que liberam suas organelas de forma não destrutiva. O homogeneizado pode ser fracionado através de centrifugação preliminar de baixa velocidade, para remover componentes de baixa densidade. Em seguida, as soluções de sacarose são preparadas.
A sacarose é adicionada em quantidades crescentes para que cada solução seja mais concentrada e, portanto, mais densa do que a anterior. As densidades exatas das soluções dependerão dos componentes a serem separados, que variam entre os organismos. As soluções devem ter densidades entre as dos componentes a serem separadas, com a última solução mais densa que o componente mais denso do analito. Técnicas para separar componentes mais densos que a sacarose, como ácidos nucleicos, são descritas nas aplicações.
O gradiente de sacarose é agora criado em um tubo de centrífuga limpo. Uma pipeta é usada para elaborar a solução de sacarose mais concentrada. Com o tubo ereto, a ponta da pipeta é colocada alta contra a parede, e o líquido dispensado constantemente para baixo. É importante que a área de trabalho seja mantida livre de vibrações e outros distúrbios.
Após a substituição da ponta, as demais soluções são adicionadas por ordem de diminuição da densidade. Eles são dispensados cuidadosamente para formar camadas distintas e evitar a mistura. Finalmente, cerca de meio mililitro da amostra celular é adicionado em cima do gradiente, e o tubo é pesado. Isso é usado para equilibrar a distribuição de peso, o próximo passo do processo.
A centrifugação deve começar o mais rápido possível. O tubo é colocado no rotor, que é então equilibrado colocando soluções em branco de igual peso em ranhuras opostas. O rotor é colocado no ultracentrifuuge e o sistema selado. A temperatura e a velocidade de rotação e o tempo estão definidos. Os valores típicos são 4 °C com uma força de mais de 100.000 x g para 16 h.
Após a centrifugação, o tubo é retirado do rotor, tomando o cuidado de mantê-lo ereto e sem ser perturbado. Os diferentes componentes celulares têm fracionadas em bandas discretas entre as camadas de solução. As frações podem ser coletadas com uma seringa. Alternativamente, a parte inferior do tubo pode ser perfurada com uma agulha fina e esterilizada e o fluxo coletado em tubos estéreis. Os componentes celulares foram agora isolados. Eles podem ser armazenados a -80 °C.
Agora que vimos o procedimento básico, vamos ver algumas aplicações.
Uma aplicação típica é o isolamento de complexos multi-proteínas em células vegetais. Neste exemplo, complexos responsáveis pelo fluxo de elétrons cíclicos estão sendo isolados da timilakoida, o local da reação de luz na fotossíntese. Este procedimento utiliza soluções discretas de 14 a 45% de sacarose. Centrifugação ocorre mais de 100.000 x g para 14 h a 4 °C.
Como os ácidos nucleicos são mais densos que a sacarose, a centrífugação isofícnica não pode separá-los das organelas não destrutivamente.
Uma técnica diferente, conhecida como “centrifugação taxa-zonal” é usada. Separa organelas com base em suas taxas de sedimentação, que dependem não apenas de suas densidades, mas também de suas conformações. Um gradiente contínuo é usado para separar os componentes com base nesta propriedade.
As etapas processuais são semelhantes às dos casos isopícnicos. Neste exemplo, os complexos RNA-ribossomo são isolados usando um gradiente contínuo de 5% a 20%, centrifuso a 230.000 x g. A centrifugação é interrompida após algumas horas para evitar co-precipitação.
Os fios de ácido nucleico podem ser separados uns dos outros com base na densidade.
Isso porque as vertentes ricas em guanina e citosina são mais densas do que as ricas em adenina e tiamina. Neste caso, o gradiente não pode ser feito de sacarose, pois a sacarose é menos densa que os ácidos nucleicos. Em vez disso, são utilizados gradientes de cloreto de césio, tipicamente de 1,65 a 1,75 g/mL, pois possuem densidade suficiente e baixa viscosidade.
Aqui vemos DNA de plâncton sendo purificado usando um gradiente contínuo de cloreto de césio. A centrifugação ocorre a mais de 1.000.000 x g por 18 h sob vácuo.
Você acabou de assistir o vídeo de JoVE sobre ultracentrifugação com um gradiente de densidade de sacarose. Agora você deve entender como funciona um gradiente de densidade, como construir um gradiente de passos e como carregar e operar uma ultracentrifuagem. Obrigado por assistir!
Procedure
Disclosures
Transcript
Density gradient ultracentrifugation is a common approach to isolate and purify cell structures for biochemical experiments. The technique uses a high-speed, or ultra, centrifuge to nondestructively separate cellular components in a density gradient. This video describes the principles of density gradient ultracentrifugation, provides a general procedure using a sucrose gradient, and discusses some applications.
Let’s start by examining the principles of ultracentrifuges and density gradients. A suspension contains particles in a liquid solvent. Because of gravity, particles denser than the solvent sediment out while those less dense than the solvent float. The greater the difference in density between the particle and the solvent, the faster the separation.
An ultracentrifuge contains a unit called a rotor, which rotates at highly controlled speeds, simulating a strong gravitational field. Within this field, the differences in density between particles and the solvent are magnified.
The strength of the field depends on the speed of rotation. Even a small rotor at a relatively low rotational speed can create a force thousands of times stronger than the earth’s gravitational field.
If a tube contains several liquids of different densities, centrifugation will keep them in separate layers in order of density, with the densest liquid closest to the base. Such a layering of multiple liquids is called a “density gradient.” There are two types. In step gradients, liquids of decreasing density are carefully layered on top one another. In continuous gradients, the liquids are mixed in varying proportions, so the density decreases smoothly from the base upwards.
Cellular organelles can be separated using a step gradient, through “isopycnic density-gradient centrifugation.” This is the simplest and most common centrifugation procedure.
This procedure is used to separate the cellular structures. The more dense the organelle, the further it descends-with mitochondria at the top and nucleic acids towards the bottom.
Now that you know the principles behind the technique, let’s see it in the lab.
Before the procedure is started, the manufacturer’s speed and density ratings should be noted, and the ultracentrifuge checked for corrosion. This procedure uses a swinging-bucket rotor.
First, the cellular material is prepared by homogenizing the cells, which nondestructively releases their organelles. The homogenate may be fractionated through preliminary low-speed centrifugation, to remove low-density components. Next, the sucrose solutions are prepared.
Sucrose is added in increasing amounts so each solution is more concentrated, and therefore denser, than the preceding one. The exact densities of the solutions will depend on the components to be separated, which vary between organisms. The solutions should have densities between those of the components to be separated, with the last solution denser than the densest component of the analyte. Techniques for separating components denser than sucrose, like nucleic acids, are described in the applications.
The sucrose gradient is now created in a clean centrifuge tube. A pipette is used to draw up the most concentrated sucrose solution. With the tube held upright, the pipette tip is placed high against the wall, and the liquid dispensed steadily down. It’s important that the working area is kept free of vibrations and other disturbances.
After replacing the tip, the remaining solutions are added in order of decreasing density. They are dispensed carefully to form distinct layers and avoid mixing. Finally, about half a milliliter of the cellular sample is added atop the gradient, and the tube is weighed. This is used to balance the weight distribution, the next step of the process.
Centrifugation should begin as soon as possible. The tube is placed in the rotor, which is then balanced by placing blank solutions of equal weight in opposing slots. The rotor is placed in the ultracentrifuge and the system sealed. The temperature and rotation speed and time are set. Typical values are 4 °C with a force of over 100,000 x g for 16 h.
After centrifugation, the tube is withdrawn from the rotor, taking care to keep it upright and undisturbed. The different cellular components have fractionated into discrete bands between the solution layers. The fractions can be collected with a syringe. Alternately, the bottom of the tube can be punctured with a fine, sterilized needle and the outflow collected in sterile tubes. The cellular components have now been isolated. They can be stored at -80 °C.
Now that we’ve seen the basic procedure, let’s look at some applications.
A typical application is the isolation of multi-protein complexes in plant cells. In this example, complexes responsible for cyclic electron flow are being isolated from the thylakoid, the site of the light reaction in photosynthesis. This procedure uses discrete solutions of 14 to 45% sucrose. Centrifugation occurs over 100,000 x g for 14 h at 4 °C.
Because nucleic acids are denser than sucrose, isopycnic centrifugation cannot separate them from organelles nondestructively.
A different technique, known as “rate-zonal centrifugation” is used. It separates organelles based on their sedimentation rates, which depend not only on their densities, but also on their conformations. A continuous gradient is used to separate the components based on this property.
The procedural steps are similar to those for isopycnic cases. In this example, RNA-ribosome complexes are isolated using a continuous gradient of 5% to 20%, centrifuged at 230,000 x g. Centrifugation is interrupted after a few hours to prevent co-precipitation.
Nucleic acid strands can be separated from each other on the basis of density.
This is because strands rich in guanine and cytosine are denser than those rich in adenine and thiamine. In this case, the gradient cannot be made of sucrose, because sucrose is less dense than nucleic acids. Instead, cesium chloride gradients, typically from 1.65 to 1.75 g/mL are used, as they have sufficient density and a low viscosity.
Here we see plankton DNA being purified using a continuous cesium chloride gradient. Centrifugation occurs at over 1,000,000 x g for 18 h under vacuum.
You’ve just watched JoVE’s video on ultracentrifugation with a sucrose density gradient. You should now understand how a density gradient works, how to construct a step gradient, and how to load and operate an ultracentrifuge. Thanks for watching!
