Ultracentrifugación con gradiente de densidad
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Overview
Ultracentrifugación de gradiente de densidad es una técnica común utilizada para aislar y purificar las estructuras de biomoléculas y células. Esta técnica aprovecha el hecho de que, en suspensión, partículas que son más densas que el disolvente serán sedimento, mientras que aquellos que son menos densas flotarán. Una ultracentrífuga de alta velocidad se utiliza para acelerar este proceso con el fin de separar biomoléculas dentro de un gradiente de densidad, que puede ser establecido por líquidos y disminución de la densidad en un tubo de centrífuga.
El video cubre los principios de la ultracentrifugación de gradiente de densidad, incluyendo un procedimiento que demuestra la preparación de la muestra, creación de un gradiente de sacarosa, ultracentrifugación y colección de analitos fraccionados. La sección de aplicaciones analiza el aislamiento de complejos, aislamiento de complejos de ácidos nucleicos y la separación mediante gradientes de densidad de cloruro de cesio.
Ultracentrifugación de gradiente de densidad es un método común para aislar y purificar las estructuras de la célula para los experimentos bioquímicos. La técnica utiliza una centrifugadora de alta velocidad, o ultra, para separar de manera no destructiva componentes celulares en un gradiente de densidad. Este video describe los principios de la ultracentrifugación de gradiente de densidad, proporciona un procedimiento general mediante un gradiente de sacarosa y analiza algunas aplicaciones.
Vamos a empezar examinando los principios de Ultracentrífugas y gradientes de densidad. Una suspensión contiene partículas en un líquido disolvente. Debido a la gravedad, las partículas más densas que el sedimento solvente hacia fuera mientras que los menos densas que el disolvente flotador. Cuanto mayor sea la diferencia de densidad entre las partículas y el solvente, el más rápido la separación.
Una ultracentrífuga contiene una unidad llamada un rotor, que gira a velocidades muy controladas, simulando un campo gravitacional fuerte. Dentro de este campo, se potencian las diferencias de densidad entre las partículas y el solvente.
La fuerza del campo depende de la velocidad de rotación. Incluso un pequeño rotor a una velocidad de rotación relativamente baja puede crear una fuerza miles de veces más fuerte que el campo gravitacional de la tierra.
Si un tubo contiene varios líquidos de diferentes densidades, centrifugación mantendrán en capas separadas por orden de densidad, con el líquido más denso más cercano a la base. Acodar de varios líquidos se llama un “gradiente de densidad”. Hay dos tipos. Gradientes de paso, los líquidos de disminuir densidad son cuidadosamente en capas en la parte superior uno con el otro. En gradientes de continuo, los líquidos se mezclan en proporciones variables, lo que la densidad disminuye suavemente desde la base hacia arriba.
Organelos celulares se pueden separar utilizando un gradiente de paso, a través de la “centrifugación del gradiente de densidad de isopicnica.” Este es el procedimiento de centrifugación más común y más simple.
Este procedimiento se utiliza para separar las estructuras celulares. El más denso el orgánulo, cuanto más desciende-con mitocondrias en la parte superior y los ácidos nucleicos hacia la parte inferior.
Ahora que conoces los principios de la técnica, vamos a ver en el laboratorio.
Antes de inicia el procedimiento, anotar calificaciones de velocidad y densidad del fabricante y la ultracentrífuga comprobado para la corrosión. Este procedimiento utiliza un rotor oscilante-cubo.
En primer lugar, el material celular se prepara por homogeneizar las células, que lanza manera no destructiva sus organelos. El homogeneizado se puede fracciona mediante centrifugación a baja velocidad preliminar, quitar componentes de baja densidad. A continuación, se preparan las soluciones de sacarosa.
Sacarosa se agrega en cantidades cada vez mayores por lo que cada solución es más concentrada y por lo tanto, más denso que el anterior. La densidad exacta de las soluciones dependerá de los componentes a separar, que varían entre los organismos. Las soluciones deben tener densidades entre los de los componentes a separar, con la última solución, más densa que el componente más denso del analito. Técnicas para separar los componentes más densos que la sacarosa, como ácidos nucleicos, se describen en las aplicaciones.
Ahora se crea el gradiente de sacarosa en un tubo de centrífuga limpio. Una pipeta se utiliza para elaborar la solución más concentrada de sacarosa. Con el tubo vertical a cabo, punta de la pipeta se coloca alta contra la pared, y el líquido dispensado continuamente hacia abajo. Es importante que el área de trabajo se mantiene libre de vibraciones y otras perturbaciones.
Después de cambiar la punta, las soluciones restantes se agregan en orden decreciente de densidad. Ellos son dispensadas cuidadosamente para formar capas distintas y evitar mezclar. Finalmente, cerca de la mitad de un mililitro de la muestra celular se agrega encima del gradiente, y se pesa el tubo. Esto se usa para balancear la distribución del peso, el siguiente paso del proceso.
Centrifugación debe comenzar tan pronto como sea posible. Se coloca el tubo en el rotor, que luego se equilibra colocando soluciones en blanco de un peso igual en las ranuras de la oposición. El rotor se coloca en la ultracentrífuga y el sistema de sellado. Se fijan la temperatura y velocidad de rotación y el tiempo. Los valores típicos son de 4 ° C con una fuerza de más de 100.000 x g durante 16 horas.
Después de la centrifugación se retira el tubo del rotor, teniendo cuidado de mantenerlo vertical y sin perturbaciones. Los diferentes componentes celulares se fracciona en bandas discretas entre las capas de la solución. Las fracciones se pueden recoger con una jeringa. Alternativamente, la parte inferior del tubo se puede pinchar con una aguja fina, esterilizada y la salida se recoge en tubos estériles. Ahora se han aislado los componentes celulares. Pueden ser almacenados a-80 ° C.
Ahora que hemos visto lo básico, vamos a ver algunas aplicaciones.
Una aplicación típica es el aislamiento de complejos en las células vegetales. En este ejemplo, complejos de flujo cíclico del electrón están siendo aislados de tilacoides, el sitio de la reacción de la luz en la fotosíntesis. Este procedimiento utiliza las soluciones discretas de 14 a 45% de sacarosa. Centrifugación produce más de 100.000 x g de 14 h a 4 ° C.
Porque los ácidos nucleicos son más densos que la sacarosa, centrifugación isopicnica no puede separarlos de organelos manera no destructiva.
Se utiliza una técnica diferente, conocida como “tarifa zonal centrifugación”. Separa organelos basados en sus tasas de sedimentación, que dependen no sólo sus densidades, sino también en sus conformaciones. Un gradiente continuo se utiliza para separar los componentes basados en esta propiedad.
Las etapas del procedimiento son similares a los casos isopicnica. En este ejemplo, los complejos de RNA ribosoma están aislados usando un gradiente continuo de 5% a 20%, se centrifugó a 230.000 x g. centrifugación se interrumpe después de unas horas para evitar la precipitación.
De ácido nucleico puede ser separado entre sí en base a la densidad.
Esto es porque las cadenas ricas en guanina y citosina son más densas que aquellas ricas en adenina y tiamina. En este caso, no se hace el gradiente de sacarosa, porque la sacarosa es menos densa que los ácidos nucleicos. En cambio, se utilizan gradientes de cloruro de cesio, de 1,65 a 1,75 g/mL, ya que tienen suficiente densidad y baja viscosidad.
Aquí vemos a plancton ADN se purificaron usando un gradiente de cloruro de cesio continua. Centrifugación se produce a más de 1.000.000 x g para 18 h bajo vacío.
Sólo has visto video de Zeus en ultracentrifugación con un gradiente de densidad de sacarosa. Ahora usted debe entender cómo funciona un gradiente de densidad, cómo construir un gradiente de paso y cómo cargar y operar una ultracentrífuga. ¡Gracias por ver!
Procedure
Disclosures
Transcript
Density gradient ultracentrifugation is a common approach to isolate and purify cell structures for biochemical experiments. The technique uses a high-speed, or ultra, centrifuge to nondestructively separate cellular components in a density gradient. This video describes the principles of density gradient ultracentrifugation, provides a general procedure using a sucrose gradient, and discusses some applications.
Let’s start by examining the principles of ultracentrifuges and density gradients. A suspension contains particles in a liquid solvent. Because of gravity, particles denser than the solvent sediment out while those less dense than the solvent float. The greater the difference in density between the particle and the solvent, the faster the separation.
An ultracentrifuge contains a unit called a rotor, which rotates at highly controlled speeds, simulating a strong gravitational field. Within this field, the differences in density between particles and the solvent are magnified.
The strength of the field depends on the speed of rotation. Even a small rotor at a relatively low rotational speed can create a force thousands of times stronger than the earth’s gravitational field.
If a tube contains several liquids of different densities, centrifugation will keep them in separate layers in order of density, with the densest liquid closest to the base. Such a layering of multiple liquids is called a “density gradient.” There are two types. In step gradients, liquids of decreasing density are carefully layered on top one another. In continuous gradients, the liquids are mixed in varying proportions, so the density decreases smoothly from the base upwards.
Cellular organelles can be separated using a step gradient, through “isopycnic density-gradient centrifugation.” This is the simplest and most common centrifugation procedure.
This procedure is used to separate the cellular structures. The more dense the organelle, the further it descends-with mitochondria at the top and nucleic acids towards the bottom.
Now that you know the principles behind the technique, let’s see it in the lab.
Before the procedure is started, the manufacturer’s speed and density ratings should be noted, and the ultracentrifuge checked for corrosion. This procedure uses a swinging-bucket rotor.
First, the cellular material is prepared by homogenizing the cells, which nondestructively releases their organelles. The homogenate may be fractionated through preliminary low-speed centrifugation, to remove low-density components. Next, the sucrose solutions are prepared.
Sucrose is added in increasing amounts so each solution is more concentrated, and therefore denser, than the preceding one. The exact densities of the solutions will depend on the components to be separated, which vary between organisms. The solutions should have densities between those of the components to be separated, with the last solution denser than the densest component of the analyte. Techniques for separating components denser than sucrose, like nucleic acids, are described in the applications.
The sucrose gradient is now created in a clean centrifuge tube. A pipette is used to draw up the most concentrated sucrose solution. With the tube held upright, the pipette tip is placed high against the wall, and the liquid dispensed steadily down. It’s important that the working area is kept free of vibrations and other disturbances.
After replacing the tip, the remaining solutions are added in order of decreasing density. They are dispensed carefully to form distinct layers and avoid mixing. Finally, about half a milliliter of the cellular sample is added atop the gradient, and the tube is weighed. This is used to balance the weight distribution, the next step of the process.
Centrifugation should begin as soon as possible. The tube is placed in the rotor, which is then balanced by placing blank solutions of equal weight in opposing slots. The rotor is placed in the ultracentrifuge and the system sealed. The temperature and rotation speed and time are set. Typical values are 4 °C with a force of over 100,000 x g for 16 h.
After centrifugation, the tube is withdrawn from the rotor, taking care to keep it upright and undisturbed. The different cellular components have fractionated into discrete bands between the solution layers. The fractions can be collected with a syringe. Alternately, the bottom of the tube can be punctured with a fine, sterilized needle and the outflow collected in sterile tubes. The cellular components have now been isolated. They can be stored at -80 °C.
Now that we’ve seen the basic procedure, let’s look at some applications.
A typical application is the isolation of multi-protein complexes in plant cells. In this example, complexes responsible for cyclic electron flow are being isolated from the thylakoid, the site of the light reaction in photosynthesis. This procedure uses discrete solutions of 14 to 45% sucrose. Centrifugation occurs over 100,000 x g for 14 h at 4 °C.
Because nucleic acids are denser than sucrose, isopycnic centrifugation cannot separate them from organelles nondestructively.
A different technique, known as “rate-zonal centrifugation” is used. It separates organelles based on their sedimentation rates, which depend not only on their densities, but also on their conformations. A continuous gradient is used to separate the components based on this property.
The procedural steps are similar to those for isopycnic cases. In this example, RNA-ribosome complexes are isolated using a continuous gradient of 5% to 20%, centrifuged at 230,000 x g. Centrifugation is interrupted after a few hours to prevent co-precipitation.
Nucleic acid strands can be separated from each other on the basis of density.
This is because strands rich in guanine and cytosine are denser than those rich in adenine and thiamine. In this case, the gradient cannot be made of sucrose, because sucrose is less dense than nucleic acids. Instead, cesium chloride gradients, typically from 1.65 to 1.75 g/mL are used, as they have sufficient density and a low viscosity.
Here we see plankton DNA being purified using a continuous cesium chloride gradient. Centrifugation occurs at over 1,000,000 x g for 18 h under vacuum.
You’ve just watched JoVE’s video on ultracentrifugation with a sucrose density gradient. You should now understand how a density gradient works, how to construct a step gradient, and how to load and operate an ultracentrifuge. Thanks for watching!
