Een Western Blotting Protocol voor kleine aantallen van hematopoietische stamcellen
Summary
Een standaard Western blotting protocol is geoptimaliseerd voor het analyseren van slechts 500 hematopoietische stamcellen of voorlopercellen. Optimalisatie houdt zorgvuldige behandeling van het monster van de cel, beperking van de overdracht tussen buizen en direct het lysing van cellen in Laemmli monster buffer.
Abstract
Hematopoietische stamcellen (HSCs) zijn zeldzame cellen, met de muis het beenmerg met slechts 25.000 ~ fenotypische lange termijn repopulatie HSCs. Een westelijke bevlekkende protocol werd geoptimaliseerd en geschikt voor de analyse van kleine aantallen HSCs (500-15.000 cellen). Fenotypische HSCs werden gezuiverd, nauwkeurig geteld en direct lysed in Laemmli monster buffer. Lysates met gelijke aantallen cellen werden geanalyseerd door elektroforese natrium dodecyl sulfaat polyacrylamidegel (SDS-pagina), en de vlek was bereide en verwerkte na standaard Westelijke Bevlekkende Protocollen. Met behulp van dit protocol, 2.000-5.000 HSCs kan routinematig worden geanalyseerd, en in sommige gevallen kunnen gegevens worden verkregen uit zo weinig als 500 cellen, in vergelijking met de cellen van de 20.000 tot 40.000 gemeld in de meeste publicaties. Dit protocol gelden over het algemeen andere hematopoietische cellen en maakt de routinematige analyse van kleine aantallen cellen met behulp van standaard laboratorium procedures.
Introduction
Hematopoietische stamcellen (HSCs) zijn zichzelf vernieuwende cellen die aanleiding tot alle bloed geslachten geven kunnen. Ze zijn relatief zeldzaam cellen in het beenmerg, waardoor biochemische analysen moeilijk. Benaderingen die geschikt zijn voor het analyseren van zeldzame cellen, zoals de stroom cytometry, zijn uiterst nuttig voor het kwantificeren van de relatieve hoeveelheden van cel oppervlakte markeringen en intracellulaire eiwitten. Echter, de analyse van intracellulaire eiwitten vereist het gebruik van cel permeabilization procedures antilichaam-toegang inschakelen, en niet alle cel oppervlakte epitopes overleven deze procedures1,2. Bovendien antilichamen die onderscheid tussen verschillende isoforms of decolleté eiwitproducten maken zijn vaak niet beschikbaar voor stroom cytometry en daarom onderzoekers nog steeds rekenen op Western blots voor bepaalde soorten analyses.
Westelijke vlekkenanalyse van cel lysates is een routineprocedure in de meeste laboratoria. Cellen onder inheemse voorwaarden die de epitopes van cel-oppervlakte molecules bewaren kunnen worden gezuiverd, en cel lysates kan vervolgens worden voorbereid en geanalyseerd. De analyse van eiwitten in zeldzame primaire cel populaties door Western blot kunt echter verplicht stellen grote aantallen dieren om voldoende cellen euthanizing. Door kleine aanpassingen aan de verschillende stappen, was een conventionele westelijke bevlekkende protocol kundig voor speurder eiwitten in relatief kleine aantallen HSCs (500-15.000, afhankelijk van de proteïne van belang). De aanpassingen omvatten nauwkeurig tellen de cellen, zorgvuldig hanteren de cel pellet, vermindering van de overdracht van cellen tussen buizen tot een minimum beperken van het verlies van de cel, en een bepaald aantal cellen met een geconcentreerde laden lysing buffer met proteasoom en phosphatase inhibitors. Vele gepubliceerde rapporten omvatten Western blots verkregen met 20.000 of meer HSCs3,4,5,6,7; deze eenvoudige procedure zal het verminderen van het aantal cellen en proefdieren nodig voor de productie van gelijkwaardige gegevens door tussen 4 en 40-voudige. Het protocol is ontworpen voor het normaliseren van resultaten op basis van de per cel, in plaats van aan een interne controle. Hierdoor kan de detectie van algemene verlagingen eiwitniveaus die worden over het hoofd gezien kunnen als gegevens worden genormaliseerd naar een interne controle. Het belang van normalisatie op basis van de per cel werd beschreven voor de analyse van gen expressie gegevens8, en hetzelfde principe geldt voor het kwantificeren van de eiwitten door westelijke vlek. Dit geoptimaliseerd protocol moet zinvol zijn voor iedereen die voor het analyseren van kleine aantallen cellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Westelijke bevlekken is een gemeenschappelijke techniek voor het opsporen van specifieke proteïnen en de activering van signaalroutes in weefsels of cellen. Door de invoering van kleine aanpassingen aan een veelgebruikte procedure, konden we 15 verschillende eiwitten (Tabel of Materials) routinematig detecteren in 15.000 HSCs, en in sommige gevallen in zo weinig als 500 HSCs. The most kritische stappen in dit protocol zijn: 1) nauwkeurig de cellen tellen, 2) het aantal overdrachten tussen buizen minimal…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
National Institutes of Health verlenen R01 CA149976 (N.A.S) dit werk ondersteund.
Materials
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166-500 | SDS-PAGE |
| TEMED | Fisher Scientific | BP150-20 | SDS-PAGE |
| 30% Acrylamidel Bis solution | Bio-Rad | 1610158 | SDS-PAGE |
| 1.5M Tris-HCl pH8.8 | TEKNOVA | T1588 | SDS-PAGE |
| 1.0M Tris-HCl pH6.8 | TEKNOVA | T1068 | SDS-PAGE |
| Ammonium Persulfate | Fisher Scientific | BP179-25 | SDS-PAGE |
| mini-protean 3 comb | Bio-Rad | 1653360 | SDS-PAGE |
Mini-PROTEAN Tetra Cell |
Bio-Rad | 1658005EDU | SDS-PAGE |
| Transfer System | Bio-Rad | 1704155EDU | transfer |
| PowerPac HC Power Supply | Bio-Rad | 1645052EDU | electrophoresis |
| Imaging System | Bio-Rad | 1708195 | signal detection |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747EDU | sample preparation |
| 10x Tris/Glycine/SDS Electrophoresis Buffer | Bio-Rad | 1610732EDU | electrophoresis |
| 2-Mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710EDU | sample preparation |
| RTA Mini PVDF Transfer Kit, for 40 blots | Bio-Rad | 1704272 | transfer |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | 11697498001 | sample preparation |
| Phosphatase Inhibitor Cocktailrs | Gold Biotechnology | GB-450-1 | sample preparation |
| EIF4G | Cell signaling | 2469 | WB antibody, validated in 1000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): Fig2 |
| p-Rps6 | Cell signaling | 4858 | WB antibody,validated in 1000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): Fig2 |
| actin(HRP conjugated) | abcam | ab49900 | WB antibody,validated in 500 cells antibody concentration: 1:5000 reference(figure): Fig1, Fig2 |
| LC-3 | Abcam | ab48394 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig5) |
| S6 | Cell Signaling | 2317 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| 4EBP1 | Cell Signaling | 9644 | WB antibody, validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| p-4EBP1 | Cell Signaling | 2855 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| TSC2 | Cell Signaling | 4308 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| HSP90 | Cell Signaling | 4877 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig5) |
| PTEN | Cell Signaling | 9188 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| mTOR | Cell Signaling | 2983 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| p-mTOR | Cell Signaling | 5536 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| PP2AB | Cell Signaling | 4953 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| p-AMPKa | Cell Signaling | 2535 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| actin | Santa Cruz | sc-47778 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:3000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| lineage depletion kit (mouse) | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | hematopoietic stem and progenitor cells purification |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-041-305 | hematopoietic stem and progenitor cells purification |
| SCF | PeproTech | 250-03 | phosphorylation stimulation |
| APC-Cy7 c-kit antibody | ThermoFisher | A15423 | cell sorting |
| anti-B220 | ThermoFisher | 48-0452-82 | cell sorting |
| anti-CD3e | ThermoFisher | 48-0031-82 | cell sorting |
| anti-Mac1 | ThermoFisher | 48-0112-82 | cell sorting |
| anti-Gr1 | ThermoFisher | 48-5931-82 | cell sorting |
| anti-Ter119 | ThermoFisher | 48-5921-82 | cell sorting |
| Spacer Plates with 1.0 mm Integrated Spacers | Bio-Rad | 1653311 | SDS-PAGE |
| BSA | Research Products International | A30075 | membrane blocking |
| serum | Atlanta Biologicals | A12450 | medium supplement |
| cell counter | Invitrogen | AMQAF1000 | cell counting |
| hemocytometer | ThermoFisher | S17040 | cell counting |
| flim | Denville Scientific | E3012 | signal detection |
| medical film processor | Konica | SRC-101A | signal detection |
| Supersignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Therom Scientific | 34096 | signal detection |
| Allegra X-15R Centrifuge (Rotor SX4750A) | Beckman Coulter | X-15R | sample preparation |
| BLUEstain protein ladder | Gold Biotechnology | P007-500 | electrophoresis |
| cell sorter | BD | FACSAria II | sample preparation |
| Incublock | Denville Scientific | I0510 | electrophoresis |
References
- Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Nolan, G. P. Coordinate analysis of murine immune cell surface markers and intracellular phosphoproteins by flow cytometry. J Immunol. 175 (4), 2357-2365 (2005).
- Du, J., et al. Signaling profiling at the single-cell level identifies a distinct signaling signature in murine hematopoietic stem cells. Stem Cells. 30 (7), 1447-1454 (2012).
- Signer, R. A., Magee, J. A., Salic, A., Morrison, S. J. Haematopoietic stem cells require a highly regulated protein synthesis rate. Nature. 509 (7498), 49-54 (2014).
- Wang, J., et al. A differentiation checkpoint limits hematopoietic stem cell self-renewal in response to DNA damage. Cell. 148 (5), 1001-1014 (2012).
- Hoshii, T., et al. mTORC1 is essential for leukemia propagation but not stem cell self-renewal. J Clin Invest. 122 (6), 2114-2129 (2012).
- Signer, R. A., et al. The rate of protein synthesis in hematopoietic stem cells is limited partly by 4E-BPs. Genes Dev. 30 (15), 1698-1703 (2016).
- Cai, X., et al. Runx1 deficiency decreases ribosome biogenesis and confers stress resistance to hematopoietic stem and progenitor cells. Cell Stem Cell. , (2015).
- Loven, J., et al. Revisiting global gene expression analysis. Cell. 151 (3), 476-482 (2012).
- JoVE Science Education Database. Using a Hemoacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).
- JoVE Science Education Database. The Western Blot. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).
- Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).
- Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. J Vis Exp. (93), e52099 (2014).
