Западных Blotting протокол для небольшого числа гемопоэтических стволовых клеток
Summary
Стандартный западной blotting протокол был оптимизирован для анализа всего лишь 500 гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток. Оптимизация предполагает тщательной обработки ячейки выборки, ограничивая передачу между трубами и непосредственно лизировать клетки в буфер Лэмли образца.
Abstract
Гемопоэтических стволовых клеток (СКК) являются редкие клетки, с костного мозга мыши, содержащие только ~ 25000 фенотипические долго срок заселив СКК. Западный blotting протокол был оптимизирован и подходит для анализа небольшого числа СКК (500-15 000 клеток). Фенотипические СКК были очищенный, точно подсчитать и непосредственно лизированы в буфер Лэмли образца. Лизатов, содержащие одинаковое количество клеток были проанализированы электрофорез геля полиакриламида сульфата натрия Додециловый (SDS-PAGE), и пятно был подготовлен и обрабатываются следующие стандартные западной blotting протоколы. Используя этот протокол, 2000-5000 СКК может регулярно анализируются, и в некоторых случаях данные могут быть получены от всего лишь 500 клеток, по сравнению с 20 000 до 40 000 ячеек, сообщили в большинстве публикаций. Этот протокол должен быть в целом применимы для других гемопоэтических клеток и позволяет рутинной анализа небольшого числа клеток с использованием стандартных лабораторных процедур.
Introduction
Гемопоэтические стволовые клетки (СКК) являются самостоятельной возобновление клетки, которые могут привести к крови всех линий. Они являются относительно редкими клеток в костном мозге, затрудняя биохимические анализы. Подходы для анализа редких клеток, таких как проточной цитометрии, оказались чрезвычайно полезными для количественной оценки относительное количество клеток поверхностных маркеров и внутриклеточные белки. Однако анализ внутриклеточных белков требует использования клеток permeabilization процедуры для включения доступа антитела, и не все клетки epitopes поверхности выжить эти процедуры1,2. Кроме того антитела, которые дискриминацию между различными белками изоформ или расщепления продуктов не часто доступны для проточной цитометрии, и поэтому следователи по-прежнему полагаться на западных помарках для определенных видов анализа.
Вестерн-блот анализ lysates клетки является обычной процедурой в большинстве лабораторий. Клетки могут быть очищены в родной условиях, которые сохраняют epitopes клеток поверхности молекул, и lysates клетки впоследствии могут быть подготовлены и проанализированы. Однако может потребовать анализ белков в редких первичной ячейке населения западной помарки, euthanizing большое количество животных, чтобы получить достаточное количество клеток. Делая небольшие изменения в несколько шагов, обычных западных blotting протокол смог обнаружить белков в относительно небольшом количестве СКК (500-15 000, в зависимости от протеина интереса). Корректировки включают точного подсчета клеток, тщательно обработки клеток Пелле, сокращение передачи ячеек между трубы к минимуму потери клеток, и лизировать определенное количество клеток с концентрированной нагрузки буфера содержащие протеасом и битор фосфатазы. Многие опубликованные отчеты включают в себя западные помарки, полученные с 20 000 или более СКК3,4,5,6,7; Эта простая процедура позволит сократить количество клеток и экспериментальных животных, необходимых для производства эквивалентных данных между 4 и 40 раз. Протокол призван нормализовать результаты на основе в ячейке, а не для внутреннего контроля. Это позволяет обнаружение общего сокращения уровня белков, которые могут быть пропущены, если данные нормализованы внутреннего контроля. Важность нормализации на основе в ячейку был описан для анализа данных выражение гена8, и тот же принцип применяется для количественной оценки белков на западную помарку. Это оптимизированный протокол должны быть полезны для тех, кто нужно анализировать небольшое количество клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Западный Blotting — это общий метод для обнаружения специфических белков и активации сигнальных путей в ткани или клетки. Путем внесения небольших изменений в часто используемые процедуры, мы смогли регулярно обнаружить 15 различных белков (Таблица материалов) в 15000 СКК и в некото?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Национальные институты здравоохранения предоставлять R01 CA149976 (N.A.S) поддержал эту работу.
Materials
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166-500 | SDS-PAGE |
| TEMED | Fisher Scientific | BP150-20 | SDS-PAGE |
| 30% Acrylamidel Bis solution | Bio-Rad | 1610158 | SDS-PAGE |
| 1.5M Tris-HCl pH8.8 | TEKNOVA | T1588 | SDS-PAGE |
| 1.0M Tris-HCl pH6.8 | TEKNOVA | T1068 | SDS-PAGE |
| Ammonium Persulfate | Fisher Scientific | BP179-25 | SDS-PAGE |
| mini-protean 3 comb | Bio-Rad | 1653360 | SDS-PAGE |
Mini-PROTEAN Tetra Cell |
Bio-Rad | 1658005EDU | SDS-PAGE |
| Transfer System | Bio-Rad | 1704155EDU | transfer |
| PowerPac HC Power Supply | Bio-Rad | 1645052EDU | electrophoresis |
| Imaging System | Bio-Rad | 1708195 | signal detection |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747EDU | sample preparation |
| 10x Tris/Glycine/SDS Electrophoresis Buffer | Bio-Rad | 1610732EDU | electrophoresis |
| 2-Mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710EDU | sample preparation |
| RTA Mini PVDF Transfer Kit, for 40 blots | Bio-Rad | 1704272 | transfer |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | 11697498001 | sample preparation |
| Phosphatase Inhibitor Cocktailrs | Gold Biotechnology | GB-450-1 | sample preparation |
| EIF4G | Cell signaling | 2469 | WB antibody, validated in 1000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): Fig2 |
| p-Rps6 | Cell signaling | 4858 | WB antibody,validated in 1000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): Fig2 |
| actin(HRP conjugated) | abcam | ab49900 | WB antibody,validated in 500 cells antibody concentration: 1:5000 reference(figure): Fig1, Fig2 |
| LC-3 | Abcam | ab48394 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig5) |
| S6 | Cell Signaling | 2317 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| 4EBP1 | Cell Signaling | 9644 | WB antibody, validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| p-4EBP1 | Cell Signaling | 2855 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| TSC2 | Cell Signaling | 4308 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| HSP90 | Cell Signaling | 4877 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig5) |
| PTEN | Cell Signaling | 9188 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| mTOR | Cell Signaling | 2983 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| p-mTOR | Cell Signaling | 5536 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| PP2AB | Cell Signaling | 4953 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| p-AMPKa | Cell Signaling | 2535 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| actin | Santa Cruz | sc-47778 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:3000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| lineage depletion kit (mouse) | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | hematopoietic stem and progenitor cells purification |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-041-305 | hematopoietic stem and progenitor cells purification |
| SCF | PeproTech | 250-03 | phosphorylation stimulation |
| APC-Cy7 c-kit antibody | ThermoFisher | A15423 | cell sorting |
| anti-B220 | ThermoFisher | 48-0452-82 | cell sorting |
| anti-CD3e | ThermoFisher | 48-0031-82 | cell sorting |
| anti-Mac1 | ThermoFisher | 48-0112-82 | cell sorting |
| anti-Gr1 | ThermoFisher | 48-5931-82 | cell sorting |
| anti-Ter119 | ThermoFisher | 48-5921-82 | cell sorting |
| Spacer Plates with 1.0 mm Integrated Spacers | Bio-Rad | 1653311 | SDS-PAGE |
| BSA | Research Products International | A30075 | membrane blocking |
| serum | Atlanta Biologicals | A12450 | medium supplement |
| cell counter | Invitrogen | AMQAF1000 | cell counting |
| hemocytometer | ThermoFisher | S17040 | cell counting |
| flim | Denville Scientific | E3012 | signal detection |
| medical film processor | Konica | SRC-101A | signal detection |
| Supersignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Therom Scientific | 34096 | signal detection |
| Allegra X-15R Centrifuge (Rotor SX4750A) | Beckman Coulter | X-15R | sample preparation |
| BLUEstain protein ladder | Gold Biotechnology | P007-500 | electrophoresis |
| cell sorter | BD | FACSAria II | sample preparation |
| Incublock | Denville Scientific | I0510 | electrophoresis |
References
- Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Nolan, G. P. Coordinate analysis of murine immune cell surface markers and intracellular phosphoproteins by flow cytometry. J Immunol. 175 (4), 2357-2365 (2005).
- Du, J., et al. Signaling profiling at the single-cell level identifies a distinct signaling signature in murine hematopoietic stem cells. Stem Cells. 30 (7), 1447-1454 (2012).
- Signer, R. A., Magee, J. A., Salic, A., Morrison, S. J. Haematopoietic stem cells require a highly regulated protein synthesis rate. Nature. 509 (7498), 49-54 (2014).
- Wang, J., et al. A differentiation checkpoint limits hematopoietic stem cell self-renewal in response to DNA damage. Cell. 148 (5), 1001-1014 (2012).
- Hoshii, T., et al. mTORC1 is essential for leukemia propagation but not stem cell self-renewal. J Clin Invest. 122 (6), 2114-2129 (2012).
- Signer, R. A., et al. The rate of protein synthesis in hematopoietic stem cells is limited partly by 4E-BPs. Genes Dev. 30 (15), 1698-1703 (2016).
- Cai, X., et al. Runx1 deficiency decreases ribosome biogenesis and confers stress resistance to hematopoietic stem and progenitor cells. Cell Stem Cell. , (2015).
- Loven, J., et al. Revisiting global gene expression analysis. Cell. 151 (3), 476-482 (2012).
- JoVE Science Education Database. Using a Hemoacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).
- JoVE Science Education Database. The Western Blot. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).
- Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).
- Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. J Vis Exp. (93), e52099 (2014).
