Summary

Bröstmjölk förbättrar tillväxten av Enteroids: ett Ex Vivo modell av cellproliferation

Published: February 15, 2018
doi:

Summary

Det här protokollet beskriver hur du upprättar en enteroid kultur system från neonatal musen eller förtida mänskliga tarmen samt en effektiv metod att samla in mjölk från möss.

Abstract

Mänskliga små intestinal enteroids härleds från kryptor och när den odlas i en stamcellsnischen innehåller alla epitelial celltyper. Förmåga att upprätta mänsklig enteroid ex vivo kultur system är viktiga att modell intestinal patofysiologi och studera de särskilda cellulära svar inblandade. Under senare år har som enteroids från mus och människa odlas, anpassade och bankas bort för framtida användning i flera laboratorier över hela världen. Denna enteroid plattform kan användas för att testa effekterna av olika behandlingar och läkemedel och vilka effekter utövas på olika celltyper i tarmen. Här, ett protokoll för att skapa primära stamceller-derived små intestinal enteroids härrör från neonatala möss och förtida mänskliga tarmen tillhandahålls. Dessutom var detta enteroid kultur system utnyttjas för att testa effekterna av artspecifika bröstmjölk. Mus bröstmjölk kan erhållas effektivt med hjälp av en modifierad mänskliga bröstcancer pump och uttryckt mus mjölk kan sedan användas för ytterligare forskningsexperiment. Vi visar nu effekterna av uttryckt mus, mänskliga, och givare bröstmjölk på tillväxt och spridning av enteroids härrör från neonatala möss eller för tidig mänsklig tunntarmen.

Introduction

Nekrotiserande enterokolit är (NEC) den ledande dödsorsaken från gastrointestinal sjukdom hos prematura spädbarn, som påverkar nästan 1 av 10 barn födda före 29 veckor dräktighet1,2,3. Hälften av barnen med NEC framsteg till den svåraste formen, där överlevnad är bara 10-30%4,5. I USA, en uppskattningsvis 2-3 miljarder USD/år spenderas behandling av spädbarn med NEC6,7, men varken överlevnaden eller terapi har förändrats under de senaste 30 åren. Patogenesen av NEC kännetecknas av intestinal skada och nedsatt slemhinnor helande8,9,10,11, dock de signalvägar som leder till ett förvärrat inflammatorisk reaktion och mekanismer för att vända inflammationen fortfarande ofullständigt förstådda.

Administrering av bröstmjölk har befunnits vara bara skyddande strategin mot NEC för prematura spädbarn. Vi har tidigare visat att bröstmjölk skyddar mot NEC utveckling genom hämning av medfödd immun receptor toll-like receptor 4 (TLR4) i intestinala epitelet via den epidermal tillväxtfaktor (EGFR) signalering väg11. Tillskott av bröstmjölk till en experimentell NEC formel försvagade den inflammatoriska reaktionen ses i NEC manifesterad genom hämning av enterocyter apoptos och restaurering av enterocyter spridning på ett sätt som var beroende av epidermal tillväxt Factor (EGF) och EGFR11. I en annan studie visades att nitrat, en annan komponent av bröstmjölk, bidrar till dess skyddande natur genom att modulera intestinal perfusion, jämfört med modersmjölksersättning, som saknas nitrat och kan bidra till ökad frekvens av NEC i formeln matas spädbarn12,13. Andra föreningar som finns i bröstmjölk som har visat sig vara inblandade i skyddet mot NEC inkluderar bröstmjölk oligosackarider, L-arginin, glutamin och Laktoferrin14,15,16, 17,18,19. Dessa positiva element av bröstmjölk avslöja nödvändigheten av dess användning i förebyggande av NEC, men betonar också vikten av att studera mekanismerna, signalering vägar och cellulära effekter inblandade i hur bröstmjölk medla skyddet mot NEC .

För att ytterligare en studie de skyddande egenskaperna av bröstmjölk i en musmodell av NEC, vi utvecklat en roman, lättanvänd teknik genom vilken mus bröstmjölk kan extraheras från en sövda dam med en elektrisk mänskliga bröstcancer pump11,12 . Denna strategi att förvärva mus bröstmjölk är fördelaktigt, inte bara eftersom mänskliga bröstpumpar är lättillgängliga och effektiva i upphandling av bröstmjölk, men också för att denna metod möjliggör artspecifika bröst mjölk analyser. Som ett resultat, vi kan jämföra effekterna av mus bröstmjölk med de av uttryckt bröstmjölk samt pastöriserad mänskliga givare mjölk från en mjölk bank i artspecifika modeller. Denna teknik möjliggör studiet av bröst mjölk komponenter i förhållande till deras bidrag till NEC förebyggande. Andra utredare har utvecklat bröst mjölk extraktionsmetoder, men dessa tekniker är manuell och kräver normalt mer än en lab medlem20,21,22. Här presenteras en enkel teknik som kan utnyttjas genom att ändra en mänsklig elektrisk bröstpump för att samla in mjölk från en mus. Denna teknik kan också tillämpas på andra arter.

För att adekvat förhöra signalvägar som är involverade med NEC, behövs modellsystem för att utvärdera alla de olika celltyper som visat sig påverkas i sjukdomsprocessen. Här diskuterar vi en sådan modellsystem – enteroids- och deras etablering från mus och människa tunntarmen. Human intestinal enteroids (HIEs) tillhandahålla i synnerhet betydande löfte, eftersom de erbjuder en innovativ, genetiskt olika ex vivo human modell till stöd i studien av patofysiologiska processer som sker i mag-tarmkanalen 23. Enteroids har befunnits vara odlade långsiktiga och kan frysas för senare användning23, och till skillnad från Human Intestinal Organoids (HIOs), vars kulturer utvecklas från inducerbara pluripotenta stamceller, enteroids genereras från stamceller inom isolerade intestinal kryptor24. Enteroids kräver mindre underhåll, kan vara infekterad snabbt25, och kan fastställas lätt eftersom tarmens kryptor är mer differentierat än HIOs23. Därför erbjuder HIEs många fördelar jämfört med befintliga metoder eftersom de kan utvecklas för att uppvisar region-specifika sammansättning och funktionella egenskaper av mänskliga mag epitel23. Användning av enteroids är ett mycket effektivt val när behov av en human modell av tarmen, med följsamhet till region-specifika begränsningar och välbefinnande-av-använda. Här visar vi tekniken för att isolera och underhålla primära stamceller-derived små intestinal enteroids från möss och prematura mänskliga spädbarn.

Protocol

Alla djur förfaranden i denna studie godkändes av antingen Washington University i St Louis institutionella djur vård och användning (protokoll 20160187) eller University of Pittsburgh institutionella djurens vård och användning kommittén (protokoll 14103918). Mänskliga fostrets tunntarmen på mindre än 24-veckors dräktighet erhölls enligt University of Pittsburgh anatomisk vävnad upphandling riktlinjer efter institutionella Review Board godkännande (protokoll PRO14100537) från University of Pittsburgh Heal…

Representative Results

Vi försökte först undersöka huruvida uttryckt bröstmjölk eller pastöriserad givare bröstmjölk hade en effekt på små intestinal enteroids. Verkligen, bröstmjölk och givare bröstmjölk ökat tillväxten av neonatal mus (figur 1A) och tidig mänsklig härledda enteroids (figur 1B). Eftersom bröstmjölk ökade tillväxten av små intestinal enteroids, unders?…

Discussion

Intestinal epitel består av många cellulära undertyper som ansvarar för att tillhandahålla värd försvar mot patogener, bibehålla tarmen barriär integritet, och kan brytas i patogenesen av flera sjukdomar. Medan djurmodeller kan sammanfatta några aspekter av sjukdomen, ger ex vivo modellen av enteroids härrör från tunntarmen av möss och människor en plattform för att testa effekterna av olika behandlingar. Betydelsen av den enteroid modellen tillåter forskare att kultur och differentieras intesti…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

MG stöds av bidrag K08DK101608 och R03DK111473 från vid National Institutes of Health, mars av Dimes Foundation Grant nr 5-FY17-79, barnens Discovery Institute i Washington University och St. Louis barns sjukhus och Institutionen för Pediatrik vid Washington University School of Medicine, St. Louis. SIVÖ stöds av R01DK104946 (PI: Silverman), barnens Discovery Institute i Washington University och St. Louis Barnsjukhus.

Materials

Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with 4.5 g/L Glucose and L-Glutamine Lonza 12-604F
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 26140-079
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
Humulin N (Insulin) Eli Lilly And Company 0002-8315
1x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) Sigma-Aldrich D8537
Gentamicin Gibco 15750-060
Amphotericin B Gibco 15290-026
0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0 Invitrogen 15575-020
1x Advanced DMEM/F-12 Invitrogen 12634-028
200 mM L-Glutamine Gibco 25030-081
1 M N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-Ethane Sulfonic Acid (HEPES) Sigma-Aldrich H3537
N-Acetylcysteine Sigma-Aldrich A9165
100x N-2 Supplement Gibco 17502-048
50x B-27 Supplement Minus Vitamin A Gibco 08-0085SA
100x ROCK Inhibitor Y-27632, Dihydrochloride Sigma-Aldrich Y0503
Recombinant Mouse Wnt3a Protein R&D Systems 1324-WN
Murine Noggin PeproTech 250-38
Recombinant Mouse R-Spondin 1 R&D Systems 3474-RS
Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF) PeproTech 315-09
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix Corning 356231
35 x 10 mm Cell Culture Petri Dish Eppendorf 0030700112
24-Well Cell Culture Plate Eppendorf 0030722116
48-Well Cell Culture Plate Eppendorf 0030723112
8-Well Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System Thermo Scientific 154534
50 mL Conical Tube Corning 352070
100 μM Sterile Cell Strainer Fisher Scientific 22-363-549
70 μM Sterile Cell Strainer Fisher Scientific 22-363-548
1x Phosphate-Buffered Saline (PBS), pH 7.2 Invitrogen 20012-027
16% Paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Sciences 15710
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Normal Donkey Serum (NDS) Sigma-Aldrich D9663
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) Invitrogen D1306
Microscope Cover Glass Fisher Scientific 12-544-D
Confocal Microscope Leica TCS SP8 X Leica Microsystems N/A
Photoshop CS6 Adobe Systems N/A
18 G 1.5 Inch Needle Becton Dickinson 305196
Isoflurane Sigma-Aldrich 792632
Oxytocin Sigma-Aldrich O3251
Human Double Electric Breast Pump Lansinoh 044677530163
5 mL Round Bottom Test Tube Corning 352058
Rubber Stoppers Frey Scientific 560761
Ki67 Antibody Abcam AB15580
Human Mki67 primer F: 5'-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3' R: 5'-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3' Integrated DNA Technologies N/A

References

  1. Patel, R. M., Denning, P. W. Therapeutic use of prebiotics, probiotics, and postbiotics to prevent necrotizing enterocolitis: what is the current evidence?. Clin Perinatol. 40 (1), 11-25 (2013).
  2. Caplan, M. S., Jilling, T. New concepts in necrotizing enterocolitis. Curr Opin Pediatr. 13 (2), 111-115 (2001).
  3. Henry, M. C., Moss, R. L. Necrotizing enterocolitis. Annu Rev Med. 60, 111-124 (2009).
  4. Lin, P. W., Stoll, B. J. Necrotising enterocolitis. Lancet. 368 (9543), 1271-1283 (2006).
  5. Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. N Engl J Med. 364 (3), 255-264 (2011).
  6. Bartick, M., Reinhold, A. The burden of suboptimal breastfeeding in the United States: a pediatric cost analysis. Pediatrics. 125 (5), e1048-e1056 (2010).
  7. Bisquera, J. A., Cooper, T. R., Berseth, C. L. Impact of necrotizing enterocolitis on length of stay and hospital charges in very low birth weight infants. Pediatrics. 109 (3), 423-428 (2002).
  8. Leaphart, C. L., et al. A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair. J Immunol. 179 (7), 4808-4820 (2007).
  9. Gribar, S. C., et al. Reciprocal expression and signaling of TLR4 and TLR9 in the pathogenesis and treatment of necrotizing enterocolitis. J Immunol. 182 (1), 636-646 (2009).
  10. Good, M., et al. Amniotic fluid inhibits Toll-like receptor 4 signaling in the fetal and neonatal intestinal epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (28), 11330-11335 (2012).
  11. Good, M., et al. Breast milk protects against the development of necrotizing enterocolitis through inhibition of Toll-like receptor 4 in the intestinal epithelium via activation of the epidermal growth factor receptor. Mucosal Immunol. 8 (5), 1166-1179 (2015).
  12. Yazji, I., et al. Endothelial TLR4 activation impairs intestinal microcirculatory perfusion in necrotizing enterocolitis via eNOS-NO-nitrite signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2013).
  13. Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 7 (2), 156-167 (2008).
  14. Bober-Olesinska, K., Kornacka, M. K. Effects of glutamine supplemented parenteral nutrition on the incidence of necrotizing enterocolitis, nosocomial sepsis and length of hospital stay in very low birth weight infants. Med Wieku Rozwoj. 9 (3 Pt 1), 325-333 (2005).
  15. Li, N., et al. Glutamine decreases lipopolysaccharide-induced intestinal inflammation in infant rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 286 (6), G914-G921 (2004).
  16. Good, M., et al. The human milk oligosaccharide 2′-fucosyllactose attenuates the severity of experimental necrotising enterocolitis by enhancing mesenteric perfusion in the neonatal intestine. Br J Nutr. 116 (7), 1175-1187 (2016).
  17. Jantscher-Krenn, E., et al. The human milk oligosaccharide disialyllacto-N-tetraose prevents necrotising enterocolitis in neonatal rats. Gut. 61 (10), 1417-1425 (2012).
  18. Akin, I. M., et al. Oral lactoferrin to prevent nosocomial sepsis and necrotizing enterocolitis of premature neonates and effect on T-regulatory cells. Am J Perinatol. 31 (12), 1111-1120 (2014).
  19. Amin, H. J., et al. Arginine supplementation prevents necrotizing enterocolitis in the premature infant. J Pediatr. 140 (4), 425-431 (2002).
  20. Rodgers, C. T. Practical aspects of milk collection in the rat. Lab Anim. 29 (4), 450-455 (1995).
  21. DePeters, E. J., Hovey, R. C. Methods for collecting milk from mice. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 14 (4), 397-400 (2009).
  22. Willingham, K., et al. Milk collection methods for mice and Reeves’ muntjac deer. J Vis Exp. (89), (2014).
  23. Saxena, K., et al. Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host Restriction, and Pathophysiology. J Virol. 90 (1), 43-56 (2015).
  24. Zachos, N. C., et al. Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology. J Biol Chem. 291 (8), 3759-3766 (2016).
  25. Drummond, C. G., et al. Enteroviruses infect human enteroids and induce antiviral signaling in a cell lineage-specific manner. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (7), 1672-1677 (2017).
  26. Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).
check_url/56921?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Lanik, W. E., Xu, L., Luke, C. J., Hu, E. Z., Agrawal, P., Liu, V. S., Kumar, R., Bolock, A. M., Ma, C., Good, M. Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation. J. Vis. Exp. (132), e56921, doi:10.3791/56921 (2018).

View Video