Det här protokollet beskriver hur du upprättar en enteroid kultur system från neonatal musen eller förtida mänskliga tarmen samt en effektiv metod att samla in mjölk från möss.
Mänskliga små intestinal enteroids härleds från kryptor och när den odlas i en stamcellsnischen innehåller alla epitelial celltyper. Förmåga att upprätta mänsklig enteroid ex vivo kultur system är viktiga att modell intestinal patofysiologi och studera de särskilda cellulära svar inblandade. Under senare år har som enteroids från mus och människa odlas, anpassade och bankas bort för framtida användning i flera laboratorier över hela världen. Denna enteroid plattform kan användas för att testa effekterna av olika behandlingar och läkemedel och vilka effekter utövas på olika celltyper i tarmen. Här, ett protokoll för att skapa primära stamceller-derived små intestinal enteroids härrör från neonatala möss och förtida mänskliga tarmen tillhandahålls. Dessutom var detta enteroid kultur system utnyttjas för att testa effekterna av artspecifika bröstmjölk. Mus bröstmjölk kan erhållas effektivt med hjälp av en modifierad mänskliga bröstcancer pump och uttryckt mus mjölk kan sedan användas för ytterligare forskningsexperiment. Vi visar nu effekterna av uttryckt mus, mänskliga, och givare bröstmjölk på tillväxt och spridning av enteroids härrör från neonatala möss eller för tidig mänsklig tunntarmen.
Nekrotiserande enterokolit är (NEC) den ledande dödsorsaken från gastrointestinal sjukdom hos prematura spädbarn, som påverkar nästan 1 av 10 barn födda före 29 veckor dräktighet1,2,3. Hälften av barnen med NEC framsteg till den svåraste formen, där överlevnad är bara 10-30%4,5. I USA, en uppskattningsvis 2-3 miljarder USD/år spenderas behandling av spädbarn med NEC6,7, men varken överlevnaden eller terapi har förändrats under de senaste 30 åren. Patogenesen av NEC kännetecknas av intestinal skada och nedsatt slemhinnor helande8,9,10,11, dock de signalvägar som leder till ett förvärrat inflammatorisk reaktion och mekanismer för att vända inflammationen fortfarande ofullständigt förstådda.
Administrering av bröstmjölk har befunnits vara bara skyddande strategin mot NEC för prematura spädbarn. Vi har tidigare visat att bröstmjölk skyddar mot NEC utveckling genom hämning av medfödd immun receptor toll-like receptor 4 (TLR4) i intestinala epitelet via den epidermal tillväxtfaktor (EGFR) signalering väg11. Tillskott av bröstmjölk till en experimentell NEC formel försvagade den inflammatoriska reaktionen ses i NEC manifesterad genom hämning av enterocyter apoptos och restaurering av enterocyter spridning på ett sätt som var beroende av epidermal tillväxt Factor (EGF) och EGFR11. I en annan studie visades att nitrat, en annan komponent av bröstmjölk, bidrar till dess skyddande natur genom att modulera intestinal perfusion, jämfört med modersmjölksersättning, som saknas nitrat och kan bidra till ökad frekvens av NEC i formeln matas spädbarn12,13. Andra föreningar som finns i bröstmjölk som har visat sig vara inblandade i skyddet mot NEC inkluderar bröstmjölk oligosackarider, L-arginin, glutamin och Laktoferrin14,15,16, 17,18,19. Dessa positiva element av bröstmjölk avslöja nödvändigheten av dess användning i förebyggande av NEC, men betonar också vikten av att studera mekanismerna, signalering vägar och cellulära effekter inblandade i hur bröstmjölk medla skyddet mot NEC .
För att ytterligare en studie de skyddande egenskaperna av bröstmjölk i en musmodell av NEC, vi utvecklat en roman, lättanvänd teknik genom vilken mus bröstmjölk kan extraheras från en sövda dam med en elektrisk mänskliga bröstcancer pump11,12 . Denna strategi att förvärva mus bröstmjölk är fördelaktigt, inte bara eftersom mänskliga bröstpumpar är lättillgängliga och effektiva i upphandling av bröstmjölk, men också för att denna metod möjliggör artspecifika bröst mjölk analyser. Som ett resultat, vi kan jämföra effekterna av mus bröstmjölk med de av uttryckt bröstmjölk samt pastöriserad mänskliga givare mjölk från en mjölk bank i artspecifika modeller. Denna teknik möjliggör studiet av bröst mjölk komponenter i förhållande till deras bidrag till NEC förebyggande. Andra utredare har utvecklat bröst mjölk extraktionsmetoder, men dessa tekniker är manuell och kräver normalt mer än en lab medlem20,21,22. Här presenteras en enkel teknik som kan utnyttjas genom att ändra en mänsklig elektrisk bröstpump för att samla in mjölk från en mus. Denna teknik kan också tillämpas på andra arter.
För att adekvat förhöra signalvägar som är involverade med NEC, behövs modellsystem för att utvärdera alla de olika celltyper som visat sig påverkas i sjukdomsprocessen. Här diskuterar vi en sådan modellsystem – enteroids- och deras etablering från mus och människa tunntarmen. Human intestinal enteroids (HIEs) tillhandahålla i synnerhet betydande löfte, eftersom de erbjuder en innovativ, genetiskt olika ex vivo human modell till stöd i studien av patofysiologiska processer som sker i mag-tarmkanalen 23. Enteroids har befunnits vara odlade långsiktiga och kan frysas för senare användning23, och till skillnad från Human Intestinal Organoids (HIOs), vars kulturer utvecklas från inducerbara pluripotenta stamceller, enteroids genereras från stamceller inom isolerade intestinal kryptor24. Enteroids kräver mindre underhåll, kan vara infekterad snabbt25, och kan fastställas lätt eftersom tarmens kryptor är mer differentierat än HIOs23. Därför erbjuder HIEs många fördelar jämfört med befintliga metoder eftersom de kan utvecklas för att uppvisar region-specifika sammansättning och funktionella egenskaper av mänskliga mag epitel23. Användning av enteroids är ett mycket effektivt val när behov av en human modell av tarmen, med följsamhet till region-specifika begränsningar och välbefinnande-av-använda. Här visar vi tekniken för att isolera och underhålla primära stamceller-derived små intestinal enteroids från möss och prematura mänskliga spädbarn.
Intestinal epitel består av många cellulära undertyper som ansvarar för att tillhandahålla värd försvar mot patogener, bibehålla tarmen barriär integritet, och kan brytas i patogenesen av flera sjukdomar. Medan djurmodeller kan sammanfatta några aspekter av sjukdomen, ger ex vivo modellen av enteroids härrör från tunntarmen av möss och människor en plattform för att testa effekterna av olika behandlingar. Betydelsen av den enteroid modellen tillåter forskare att kultur och differentieras intesti…
The authors have nothing to disclose.
MG stöds av bidrag K08DK101608 och R03DK111473 från vid National Institutes of Health, mars av Dimes Foundation Grant nr 5-FY17-79, barnens Discovery Institute i Washington University och St. Louis barns sjukhus och Institutionen för Pediatrik vid Washington University School of Medicine, St. Louis. SIVÖ stöds av R01DK104946 (PI: Silverman), barnens Discovery Institute i Washington University och St. Louis Barnsjukhus.
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with 4.5 g/L Glucose and L-Glutamine | Lonza | 12-604F | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Humulin N (Insulin) | Eli Lilly And Company | 0002-8315 | |
1x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | |
0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0 | Invitrogen | 15575-020 | |
1x Advanced DMEM/F-12 | Invitrogen | 12634-028 | |
200 mM L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
1 M N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-Ethane Sulfonic Acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3537 | |
N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
100x N-2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
50x B-27 Supplement Minus Vitamin A | Gibco | 08-0085SA | |
100x ROCK Inhibitor Y-27632, Dihydrochloride | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
Recombinant Mouse Wnt3a Protein | R&D Systems | 1324-WN | |
Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
Recombinant Mouse R-Spondin 1 | R&D Systems | 3474-RS | |
Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 315-09 | |
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | |
35 x 10 mm Cell Culture Petri Dish | Eppendorf | 0030700112 | |
24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf | 0030722116 | |
48-Well Cell Culture Plate | Eppendorf | 0030723112 | |
8-Well Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Thermo Scientific | 154534 | |
50 mL Conical Tube | Corning | 352070 | |
100 μM Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
70 μM Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
1x Phosphate-Buffered Saline (PBS), pH 7.2 | Invitrogen | 20012-027 | |
16% Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
Normal Donkey Serum (NDS) | Sigma-Aldrich | D9663 | |
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-D | |
Confocal Microscope Leica TCS SP8 X | Leica Microsystems | N/A | |
Photoshop CS6 | Adobe Systems | N/A | |
18 G 1.5 Inch Needle | Becton Dickinson | 305196 | |
Isoflurane | Sigma-Aldrich | 792632 | |
Oxytocin | Sigma-Aldrich | O3251 | |
Human Double Electric Breast Pump | Lansinoh | 044677530163 | |
5 mL Round Bottom Test Tube | Corning | 352058 | |
Rubber Stoppers | Frey Scientific | 560761 | |
Ki67 Antibody | Abcam | AB15580 | |
Human Mki67 primer F: 5'-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3' R: 5'-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3' | Integrated DNA Technologies | N/A |