Summary
Nye protokoller er beskrevet her til at isolere og karakterisere mikropartikler stammer fra menneskelige og mus neutrofiler. Disse protokoller udnytte ultracentrifugering, flowcytometri og immunoblotting teknikker til at analysere microparticle indhold, og de kan bruges til at studere rollen af mikropartikler afledt af forskellige celletyper i cellefunktion.
Abstract
Polymorfnukleære neutrofile-afledte mikropartikler (PMN)-MPs) er lipid tolagede, sfærisk microvesicles med størrelser spænder fra 50-1.000 nm i diameter. MPs er et nyligt udvikling, vigtig del af celle-til-celle kommunikation og signalering maskiner. På grund af deres størrelse og arten af deres frigivelse, indtil for nylig blev MP eksistens overset. Dog med forbedret teknologi og analysemetoder er deres funktion i sundhed og sygdom nu fremstår. Protokollerne præsenteres her er rettet mod isolerer og karakteriserer PMN-MPs ved flowcytometri og immunoblotting. Derudover gives flere gennemførelsen eksempler. Disse protokoller for MP isolation er hurtig, billig, og kræver ikke brug af dyre kits. Desuden, de giver mulighed for mærkning af MPs efter isoleret, samt præ mærkning af datakildens celler før MP udgivelse, ved hjælp af en membran-specifikke fluorescerende farvestof til visualisering og analyse ved flowcytometri. Disse metoder, men har flere begrænsninger herunder renheden af PMNs og MPs og behovet for sofistikeret analytiske instrumentation. En high-end flow Flowcytometret er nødvendig for at pålideligt analysere MPs og minimere falske positive læser på grund af støj eller auto-fluorescens. De beskrevne protokoller kan bruges til at isolere og definere MP Biogenese og karakterisere deres markører og variation i sammensætning på forskellige stimulerende betingelser. Størrelse heterogenitet kan udnyttes til at undersøge, om indholdet af membran partikler versus exosomes er forskellige, og hvorvidt de opfylder forskellige roller i væv homøostase. Endelig, følgende isolering og karakterisering af parlamentsmedlemmer, deres funktion i cellulære svar og forskellige sygdomsmodeller (herunder, PMN-associerede inflammatoriske lidelser, såsom inflammatoriske tarmsygdomme eller akut lunge skade) kan udforskes.
Introduction
For nylig, "mikropartikler/microvesicles" stammer fra celle cytosol eller plasma membran er blevet af stor videnskabelig interesse, da nye data tyder på, at disse strukturer, spænder fra 50-1.000 nm i diameter, kan bære biologiske oplysninger og tjene som en ikke-kanoniske metode til cellulære kommunikation. Immun celle-afledte parlamentsmedlemmer og især dem, der produceres af polymorfkernede neutrofile (PMNs) er af stor interesse på grund af PMNs vigtige rolle i vært forsvar1,2, inflammatoriske respons3og sårheling 4. intriguingly, hidtil, talrige rapporter har vist både pro-inflammatoriske og anti-inflammatoriske funktioner PMN-MPs5, tyder på en potentiel kontekst - sygdom-, arter- og orgel-specifikke rolle af MPs.
Beskrevet protokoller i denne meddelelse giver en omkostningseffektiv, innovative og fleksibel metode til at studere funktionen af parlamentsmedlemmer i sundhed og sygdom. De er gældende for mange modelorganismer, organer og stimulation betingelser. De giver mulighed for identifikation af flere typer af MPs og kan bruges i fremtiden til at adressere deres pro-inflammatoriske og anti-inflammatoriske funktioner. Som et eksempel, beskrevet her er hvordan at studere funktionen af PMN-parlamentsmedlemmer i epitelial sår healing in vitro- og in vivo. Den præsenterede protokol til isolation af musen knoglemarv-afledte PMNs blev tilpasset med applikationsprogrammerne fra en tidligere beskrevne metode6.
Derudover protokoller er beskrevet i denne undersøgelse giver mulighed for påvisning og karakterisering af specifikke markører, der kan findes på PMN-MPs af to komplementære metoder: Western blot og flow flowcytometri. Vi finder, at immunoblotting af MPs bruger standardprotokoller5 er nem og pålidelig, men de seneste fremskridt i følsomhed flow flowcytometri instrumenter og forbedret støj til signal forholdet nu tillade til videre analyse af MPs ved hjælp af denne metode. Protokollerne beskrevet i denne undersøgelse inddrage de seneste fremskridt og anbefalinger fra originale forskningsartikler, herunder ændringer til centrifugering hastighed og tid, tilsætning af prøven filtrering og frysning/opbevaring betingelser7 , 8, og hvordan man kan reducere "baggrundsstøj", forbedre detektionsgraensen for PMN-MPs og diskriminere mellem forskellige størrelser af MPs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr arbejde blev godkendt af den nordvestlige IACUC. Alle eksperimenter blev udført i overensstemmelse og overensstemmelse med alle relevante lovgivningsmæssige og institutionelle retningslinjer. For forsøgspersoner donere blod, blev et informeret samtykke forelagt og underskrevet; Derudover blev alle forsøgspersoner i denne undersøgelse behandlet i overensstemmelse med de institutionelle og føderale retningslinjer for menneskelig velfærd.
Bemærk: Protokol trin er anført under de følgende underafsnit: (i) mus knoglemarv celle Isolation; (ii) PMN Isolation fra Murine knoglemarv; (iii) PMN Isolation fra humant blod; (iv) MP Isolation fra PMN analysere (af ultracentrifugering); (v) karakterisering af MPs ved Western Blotting; (vi) karakterisering af MPs ved flowcytometri; (viii) anvendelse af isoleret MPs til undersøgelse sår Healing
1. Mouse knoglemarv celle Isolation
-
Dissektion af lårben og skinneben fra mus bagbenene
- Forberede en aktiv dødshjælp boks (f.eks, en tom 1 mL tip box) for indånding af anæstesi. Tilsæt et par dråber af 100% isofluran på en steril klud tapede til indersiden af en plastik kasse låg. Som ny IACUC retningslinjer, bør dyr ikke kommer i direkte kontakt med isofluran, således sted en spids holder mellem musen og gaze indeholdende isofluran.
Bemærk: Isofluran er en kraftig slimhindeirritation anæstesi og skal håndteres med ekstrem forsigtighed inde i et stinkskab. - Aflive mus som pr IACUC anbefaling. Placer musen inde i boksen eutanasi beskrevet taktfast 1.1.1 for 1-5 min, indtil det er ophørt vejrtrækning. Sikre dyrets død ved at udføre en cervikal dislokation.
- Løft den abdominale huden ved hjælp af rustfrit stål, 12 cm buet, 0,17 mm X 0,1 mm pincet og skære huden halvvejs mellem de øvre og nedre ekstremiteter. Skræl huden herfra til den mest distale del af musen kroppen herunder underekstremiteterne. Med 10 cm lange, lige dissekere saks, fjerne musklerne fra bagbenene og splitte hofteleddet forlader lårbenet hovedet intakt.
- Brug saks til at dissekere muskler fra lårbenet og skinnebenet og adskille lårbenet fra skinnebenet. Sørg for enderne af knoglerne forbliver intakt, da de indeholder betydelige mængder af knoglemarven.
- Fjerne alle resterende kød af rullende knogler inde i et stykke køkkenrulle. Placer de ren knogler i en petriskål, indeholdende serumfrit Medium (SFM, dvsDulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) uden serum eller antibiotika).
- Skyl knoglerne i 70% ethanol og derefter i bæredygtig skovforvaltning.
- Forberede 50 mL af SFM i en 50 mL konisk slange. Indlæse 10 mL af SFM i en 10 mL sprøjte og tillægger en 25 og 5/8 tommer gauge kanyle.
- Trim slutningen af knoglerne med saks, indtil en åbning til knoglemarven (rødlig farve) er synlige.
- Skyl knoglemarv celler ind i en ny 50 mL rør. Bruge en 10 mL sprøjte med en 26 og 5/8 tommer gauge kanyle med ca 3 mL/knogle af bæredygtig skovforvaltning. Når du er færdig, rødmen, resuspend celler i røret af pipettering (brug engangs 1 mL plastik tips) for at bryde celle aggregater.
- Forberede en aktiv dødshjælp boks (f.eks, en tom 1 mL tip box) for indånding af anæstesi. Tilsæt et par dråber af 100% isofluran på en steril klud tapede til indersiden af en plastik kasse låg. Som ny IACUC retningslinjer, bør dyr ikke kommer i direkte kontakt med isofluran, således sted en spids holder mellem musen og gaze indeholdende isofluran.
2. PMN Isolation fra Murine knoglemarv
-
Red cell lysis
- Pellet indsamlede knoglemarven ved centrifugering ved 350 x g i 8 min. ved 4 ° C.
- Resuspenderes celle i 20 mL 0,2% NaCl til ca 20-30 s til at lyse erytrocyt brøkdel. Ikke overstiger 30 s som dette vil resultere i PMN lysering. Der tilsættes 20 mL af 1,6% NaCl gendanne osmolalitet.
Bemærk: Dette trin kan føre til meget lidt PMN aktivering. - Cellerne vaskes med 2 mL af PBS, og der centrifugeres som i trin 2.1.1 ovenfor. Fjern supernatanten.
- Fortsæt til isolerende PMNs af tæthed gradient centrifugering.
-
Isolation af neutrofiler ved tæthed gradient centrifugering
- Varm polysucrose og natrium diatrizoate løsninger med tætheder af 1.119 g/mL og 1.077 g/mL (Se Tabel af materialer), til stuetemperatur (RT) før brug.
- Forberede polysucrose og natrium diatrizoate forløb frisk, umiddelbart før knoglemarv celle anvendelse af langsomt lagdeling 3 mL af 1.077 g/mL tæthed over 3 mL af 1.119 g/mL tæthed i 15 mL konisk rør.
Bemærk: Forberedelse af den gradient løsning for langt i forvejen vil resultere i blanding af lag og dårlige neutrofile renhed og nyttiggørelse. - Resuspenderes knoglemarv celle i 1 mL iskold PBS og overlay den resulterende cellesuspension oven på polysucrose og natrium diatrizoate gradient (langsomt, at undgå at blande lagene).
- Der centrifugeres i 30 min. ved 850 x g ved 25 ° C på RT, uden bremse. Holde reagenserne på RT for effektiv adskillelse af neutrofiler fra andre celler i knoglemarven. Sæt centrifugeres ved langsom deceleration at give mulighed for gradient effektivt dannes og vedligeholdes efter centrifugering trin.
- Synligt lokalisere en mononukleære cellelag på grænsefladen af PBS og 1.077 g/mL tæthed løsning (øverste lag). Fjerne dette lag og resten af tæthed løsningen uden at forstyrre PMN band.
- Indsamle en hel PMN lag og nogle af de underliggende polysucrose og natrium diatrizoate 1.119 g/mL opløsning til 15 mL rør ved hjælp af en overførsel pipette.
Bemærk: Renhed af de isolerede PMNs vil afhænge af en fuldstændig fjernelse af det øverste lag. - Top rør med filtreret PBS (filtreret gennem en 0,1 µm pore størrelse filter) og centrifugeres ved 300 x g i 5 min. ved 4 ° C.
- Vaske de pelleted PMNs med 2 mL PBS ved hjælp af centrifugeringsbetingelserne som i trin 2.2.7.
- Resuspend i 1 mL filtreret PBS og tælle de isolerede PMNs af hemocytometer.
Bemærk: For denne isolation metode, den resulterende PMN renhed beløber sig til ~ 85-90%, som blev vurderet ved flowcytometri. De resterende forurener fraktioner består primært af mononukleære lymfocytter.
-
PMN stimulation til at fremkalde MP frigivelse
Bemærk: PMNs kan stimuleres til at frigive MPs ved hjælp af forskellige aktiverende betingelser, herunder N-formyl-l-methionyl-leucyl-l-phenylalanine (fMLF), phorbol-12-myristate-13-acetat (PMA) eller Interferon gamma (IFNγ). Vigtigere, før simulation, skal PMNs holdes på is på alle tidspunkter.- Pellet PMNs (300 x g, 5 min, 4 ° C) og resuspend i 0,1 µm filtreret Hank's Balanced Salt løsning (HBSS) løsning, der indeholder stimulerende agent for valg. For optimal stimulation, skal du bruge 100 µL stimulation løsning pr. 10 millioner PMNs for 20-30 minutter ved 37 ° C i 15 mL rør.
Bemærk: De følgende koncentrationer af aktivatorer blev med succes anvendt i vores tidligere arbejde: fMLF (0,5-1 µM for menneske- og 2-5 µM til mus PMNs), PMA (200 nM), og IFNγ (100 ng/mL). Hvis udgivelsen af forud mærket MPs ønskes, inkuberes unstimulated PMNs (1-5 x 106) med N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC (Se Tabel af materialer) (1 µM i 100 µL HBSS, 15 min, 37 ° C). Fortsæt med trin 2.3.1-2.3.3. - Spin ned på 850 x g i 5 min. ved 4 ° C, til at fjerne PMNs og overføre celle-gratis supernatanter til nye 1,5 mL microcentrifuge rør.
- For MP isolation fra celle-fri supernatanter, skal du fortsætte tiltrin 4.2.
- Pellet PMNs (300 x g, 5 min, 4 ° C) og resuspend i 0,1 µm filtreret Hank's Balanced Salt løsning (HBSS) løsning, der indeholder stimulerende agent for valg. For optimal stimulation, skal du bruge 100 µL stimulation løsning pr. 10 millioner PMNs for 20-30 minutter ved 37 ° C i 15 mL rør.
3. PMN Isolation fra humant blod
-
Rekruttere raske frivillige for blod udvinding efter institutionelle IRB retningslinjer.
- Indsamle blod fra underarm af sunde frivillig i kommercielt tilgængelige 5 mL natriumcitrat-holdige rør (Se Tabel af materialer).
- Der afpipetteres 5 mL af dextran og natrium diatrizoate løsning (tæthed af 1.113 g/mL, se Tabel af materialer) i sterilt 15 mL rør og langsomt lag 5 mL frisk isolerede menneskelige perifert blod på toppen af det.
- Der centrifugeres rør til 50 min. ved 400 x g på RT (25 ° C) med lav acceleration og ingen bremse.
- I slutningen af centrifugeringen, fjerne plasma og mononukleære celler (øverste lag) ved hjælp af et sterilt plastik suge pipette.
- Overføre det nederste lag (PMNs) ind i en ny steril 50 mL konisk rør.
- Tilføje et lige saa stort volumen af 0,45% NaCl til PMNs (mix godt og forsigtigt ved at dreje røret).
- Der centrifugeres i 10 min. ved 400 x g ved 25 ° C.
-
Red cell lysis
- Der tilsættes 10 mL af iskold, sterilt vand til pelleted celler for 45 s efterfulgt af 10 mL iskold sterile 1,8% NaCl gendanne osmolalitet.
Bemærk: Alle følgende trin til PMN isolation skal udføres på isen for at undgå PMN aktivering og tidlig MP frigivelse. Trinnet lysis, sig selv resulterer i mindre, men ikke signifikant PMN aktivering, men det er vigtigt til at isolere en ren PMN befolkning for funktionelle assays. - Der centrifugeres celler i 10 min ved 250 x g ved 4 ° C med bløde deceleration.
- Gentag trin 3.2.1 og 3.2.2.
- Resuspend PMNs i 5 mL iskold HBSS uden calcium eller magnesium. Tælle samlede levende celler (brug en hemocytometer og levedygtighed farvning på 1:2 fortynding, se Tabel af materialer) før stimulation.
Bemærk: Isoleret PMNs bør anvendes til stimulation eller andre eksperimenter inden for 2 h af isolation for at undgå funktionelle og cellulære ændringer og celledød.
- Der tilsættes 10 mL af iskold, sterilt vand til pelleted celler for 45 s efterfulgt af 10 mL iskold sterile 1,8% NaCl gendanne osmolalitet.
4. MP Isolation fra aktiveret PMN analysere
Bemærk: En lignende protokol bruges til isolering af parlamentsmedlemmer fra murine og menneskelige PMNs.
- Pellet PMNs (300 x g, 5 min, 4 ° C) og resuspend i 0,1 µm filtreret HBSS løsning, der indeholder stimulerende agent for valg (for eksempel 1 µM fMLF, se Note: 2.3.1). Bruge 100 µL stimulation løsning pr. 10 millioner PMNs til 20-30 minutter ved 37 ° C i 15 mL rør for optimal stimulation.
- Følgende stimulation, spin ned aktiveret PMNs ved 600 x g i 5 min. ved 4 ° C og overføre celle-gratis supernatanter til nye 1,5 mL microcentrifuge rør.
- Der centrifugeres PMN-ryddet supernatanten på 13.000 x g, 10 min, 4 ° C til at fjerne celle debris og overføre ryddet supernatanten ind i en ny ultracentrifuge rør.
- Der centrifugeres i 1 h på 100.000 x g, ved 4 ° C. Fjerne analysere før MP opbevaring. Efter behov, store pelleted MPs i paraffin forseglet ultracentrifuge rør ved-80 ° C indtil brug i eksperimenter.
5. undersøgelse af PMN-parlamentsmedlemmer ved Western Blotting
- Tilføj 1% SDS buffer (50-200 µL med 100 mM Tris pH-værdi: 7,4) til MPs pellet (fra trin 4.4), overførsel til nye 1,5 mL microcentrifuge rør og kog de lysed parlamentsmedlemmer i 5 min.
Bemærk: Antallet af parlamentsmedlemmer og lysis buffer volumen skal justeret og optimeret til hvert protein af interesse. -
Indlæse lige store mængder af PMN-MPs pr. vognbane i loading bufferen indeholder 10% β-mercapto-ethanol.
Bemærk: Med vores metode vi indlæse hovedplan, der blev isoleret fra det samme antal stimuleret PMNs.- Separat lysates af SDS-PAGE på 10% polyacrylamid gel (bruge 50-100 V i 1-1,5 timer) og overføre samlede proteiner på nitrocellulose membraner som beskrevet9.
- Blokere membraner for 1 t med 5% fedtfrit mælk i 0,05% Tween-20 Tris-bufferet saltvand, og Inkuber det med en passende primær (natten over ved 4 ° C), efterfulgt af sekundære HRP-konjugerede antistoffer.
- Visualisere bånd ved at tilføje chemoluminescence løsning til membran, udsættelse for en X-ray film inde i en lys-bevis kassette (1-24 h).
6. undersøgelse af PMN-parlamentsmedlemmer ved flowcytometri
-
For antistoffarvning, fortyndes antistoffer korrekt i FACS buffer (PBS med 0,1 mM EDTA, 0,1% natriumazid). Resuspend pelleted PMN-MPs (afledt fra 1-3 x 106 PMNs/tilstand) i 100 µL antistof løsning.
- Hvis farvning for Annexin V, resuspend pelleted PMN-parlamentsmedlemmer i Annexin V buffer indeholdende 5 µL af FITC-konjugeret Annexin V. Hvis Co farvning med antistoffer, skal du tilføje de ønskede antistoffer (for et eksempel Se Tabel af materialer) direkte til Annexin V løsning. Tilføje fluorescerende lipid farvestof, N-(2-aminoethyl) maleimide (Se Tabel af materialer), på 1 µM koncentration i 100 µL af FACS buffer til etiket og identificere MPs.
- Inkuber MPs i farvning løsning i mindst 20 min. ved 4 ° C.
- Vaske hovedplanen af ultracentrifugering (1 h på 100.000 x g, ved 4 ° C); supernatanten.
- Resuspend i FACS buffer og køre prøverne på en udpegede flow Flowcytometret udstyret med en opgraderet elektronisk enhed til øget følsomhed (Se Tabel af materialer).
7. ansøgninger om isolerede PMN-parlamentsmedlemmer til at studere PMN funktion i sårheling
-
In vivo administration af PMN-parlamentsmedlemmer til Colon sår
- Bedøver mus ved en intraperitoneal injektion af en blanding af ketamin (100 mg/kg) og xylazin (5 mg/kg). Bekræft anæstesi ved pedal refleks (fast tå knivspids) og justere efter behov.
- Placer musen på sin mave og bruge 28 cm biopsi pincet og et endoskop, udstyret med en høj opløsning kamera (såsom en veterinær endoskop til små dyr brug, se Tabel af materialer), generere 3-5 overfladiske sår langs den dorsale side af den kolon. Efter afslutningen af såret placeret tilbagevenden mus til et bur på en temperatur-kontrolleret (37 ° C) mat indtil tilbagebetalt.
- Bedøver mus (som i trin 7.1.1). Bruge et endoskop for at erhverve billeder af selvforskyldt sår 24 timer (dag 1) post såret. Lad mus inddrive som i trin 7.1.2.
- På samme tid (24 timer efter såret), administrere murine PMN-MPs afledt af 2 x 106 PMNs i 100 µL af HBSS + direkte ind i hver sår websted ved hjælp af en koloskopi-baserede mikroinjektion system (brug en 29 G kanyle)9. Tre dage senere (dag 4 post såret) bedøver mus (som i trin 7.1.1) og bruge en endoskop for at genanskaffe billeder af healing sår. Lad mus inddrive som i trin 7.1.2.
- Ved hjælp af foretrukne billede analyse software (Se Tabel af materialer), kontur synlige sår regioner i erhvervede billeder, foranstaltning inden for det samme sår på dag 1 og 4 post såret, og beregne procentdelen af sår lukning.
-
Menneskelige epitel celler in vitro- sårheling
- Grev Caco-2 BBe eller T84, menneskelige intestinal epitelceller af hemocytometer og frø 5 x 105 celler/brønd i 24-og kultur plader. Inkuber celler i en standard inkubation kammer ved 37 ° C og 5% CO2. CaCO-2 BBe eller T84 nå confluency inden for 48 h9. At kultur epitelceller, brug DMEM og DMEM-F12 (50/50) med kosttilskud som tidligere beskrevet9.
- Generere mekaniske scratch sår i éncellelag ved hjælp af en pipette tip og lav suge som tidligere beskrevet4,9. Erhverve billeder af sår områder umiddelbart efter aflysning ved hjælp af en omvendt fasekontrast differential interferens mikroskop (brug 5 X eller 10 X mål), der skal bruges som en tid = 0 referencepunkt.
- Tilføje MPs (afledt fra 2-4 X 106 PMNs) til ridset-såret epitelcelle encellelag, og Inkuber i et yderligere 24 h (48 timer efter sårede, ved 37 ° C med 5% CO2). På dette tidspunkt igen erhverve billeder af bunden-sår.
- Brug foretrukne billede analyse software (Se Tabel af materialer) til at måle sår områder på t = 0 og t = 48 h. Beregn procentdel af sår lukning ved at bestemme forskellen i såret område på de valgte tidspunkter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Repræsentative flow cytometric analyse af parlamentsmedlemmer, der blev isoleret fra mennesker og mus PMNs er vist i figur 1. Størrelse heterogenitet af PMN-parlamentsmedlemmer kan vurderes ved en sammenligning til kendte mellemstore perler som vist i figur 1A, B for menneskelige MPs. Bemærk, blev ingen betydelige forskelle i størrelse heterogenitet observeret mellem mus og menneskelige MPs. På samme måde kan bruger flowcytometri og fluorescens mærkning, udtryk for protein/s valg af isolerede parlamentsmedlemmer af enten musen eller human oprindelse bestemmes. For eksempel udtryk for phosphatidylphosphatid Serin (PhS) kan undersøges af Annexin V farvning. Murine knoglemarv PMN-MPs er vist i figur 1C, D. Udtryk for flere markører for valg kan også vurderes, som vist for Annexin V og CD11b farvning af menneskelige MPs, figur 2A, B. En anden metode til at registrere PMN-parlamentsmedlemmer ved flowcytometri er at plette frisk isoleret PMNs før stimulation som vist i figur 2C. For eksempel PMN farvning med lipid markør N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC før fMLF stimulation resulterer i frigivelse af grønne MPs, der kan let påvises ved flow. Af note, mens farvning med N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC har tidligere er blevet anvendt til at mærke og registrere hovedplan, der blev fremstillet af perifere blod10 eller injiceres dyr11, brugen af andre markører for mærkning formål for in vitro- eller i vivo ansøgning bør fastsættes af hver investigator. Ud over flowcytometri, kan PMN-parlamentsmedlemmer analyseres af immunoblotting for proteiner af interesse. Som vist i figur 3, MPs stammer fra menneskelige PMNs, der blev stimuleret med flere kendte aktivatorer, blev undersøgt for udtryk for nøglen inflammatoriske (matrix metallopeptidase 9 (MMP-9) og myeloperoxidase (MPO)) og anti-inflammatoriske (Annexin A1) molekyler. Som fremgår af repræsentative immunoblots, PMN stimulation med IFNγ (50 ng/mL), PMA (200 nM), og fMLF (1 µM) resulterede i parlamentsmedlemmer giver udtryk for forskellige grader af MMP-9. Dog kun undertrykkelse af netbårne af actin cytoskelettet af Latrunculin B (1 µM) forud for stimulation med fMLF (5 µM) førte til rigelige tilstedeværelsen af MPO i PMN-parlamentsmedlemmer. Ligeledes blev varierende niveauer af Annexin A1 (højt at ingen registrering) fundet på MPs følger de beskrevne aktiverende betingelser. Disse resultater tyder på, at PMN-MP sammensætning er stimulus-afhængige.
Endelig, figur 4 viser, hvordan isolerede PMN-parlamentsmedlemmer kan bruges til at studere sår healing i in vitro og i vivo i Colon skade. PMN-parlamentsmedlemmer kan føjes til bunden-såret epitelial encellelag i kulturer, hvor helbredelse kan overvåges af imaging erhvervelse på forud fastsatte tidspunkter. Parlamentsmedlemmer kan yderligere være microinjected direkte i Colon sår, der blev genereret af biopsi pincet og endoskopisk imaging9, og deres virkning på healing kan vurderes. For både in vitro og i vivo analyse af sårheling, billeder af selvforskyldt sår er erhvervet straks indlæg såret (eller andet som angivet) og løbende gennem den helbredende proces på forud fastsatte tidspunkter. Ved hjælp af kommercielt tilgængelige billede analyse software ændringer i såret område (størrelse) måles og bruges til at bestemme sår lukning hastigheden. Anvendelse af PMN-MPs, som indeholder MPO enten kulturperler epitelial encellelag eller i vivo til Colon sår har skadelige virkninger, fører til forsinkede helbredende9.
Figur 1 . Analyse af PMN-MP størrelse og overflade markører ved flowcytometri. (A) Flow forskellige optimeret kontrol perler (Se Tabel af materialer) af kendte størrelser og scatter værdier er vist i den videnskabelige Styringskomité og FSC ortogonale repræsentation. Perlerne anvendes til at få en relativ størrelse sammenligning med en PMN-MP eksempel vist i B. (B) menneskelige PMN-parlamentsmedlemmer blev isoleret og analyseret ved flowcytometri ved hjælp af betingelser beskrevet for perler. Heterogenitet i MP størrelser kan ses. (C-D) MPs stammer fra fMLF-stimuleret murine knoglemarv PMNs blev analyseret ved flowcytometri. Repræsentative flow diagrammer viser unstained (C) eller Annexin V-FITC-farvede (D) MPs. rektangulære område viser Annexin V-positive MPs (FITC-positive MPs). SSC: Side Scatter; FSC: Forward Scatter; PhS: Phosphatidylphosphatid serin. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . PMN-MP farvning og analyse ved flowcytometri. (A) Unstained og (B) Annexin V-FITC - og hCD11b-APC-farvede MPs. Square område omslutter en Annexin V/CD11b dobbelt positive befolkning af PMN-MPs. (C) frisk isolerede menneskelige PMNs (1 x 106) var farvet med et fluorescerende farvestof , N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC og stimuleret med fMLF. MPs blev isoleret fra celle analysere og analyseret ved flowcytometri. Rektangulære område omslutter et N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC positive MP befolkning (M-FITC, y-aksen etiket). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Sammensætning af PMN-MPs er stimulus-afhængige. (A) menneskelige PMNs blev stimuleret med enten IFNγ, TNFα, fMLF, PMA, eller en kombination af latranculin B efterfulgt af fMLF (LtB-fMLF). MPs blev isoleret fra de resulterende celle analysere af ultracentrifugering og protein lysates blev udarbejdet i 1% SDS buffer. Proteiner var adskilt af størrelse electrophoretically i en 10% polyacrylamid gel, overføres til en nitrocellulose membran og probed for enten en MMP-9, MPO eller Annexin A1 primære antistof efterfulgt af de relevante HRP-konjugerede sekundære antistoffer. (B) repræsentative elektronmikroskopi billeder af menneskelige PMN-MPs skildrer størrelse heterogenitet. En exosome < 100 nm i størrelse er angivet med den hvide pil. Skalalinjen = 250 nm (venstre og højre paneler). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Brug af isolerede PMN-parlamentsmedlemmer i at studere PMNs rolle i epitelial sårheling. (A) Caco-2 BBe menneskelige intestinal epitelceller blev forgyldt confluency, scratch-såret og underkastet en MPs stammer fra 3 millioner PMNs, som blev tilføjet umiddelbart efter såret. Repræsentative billeder viser sår lukning (48 timer efter sårede) i kontrol (venstre paneler) og PMN-MP-behandlede epitelceller (højre paneler). Skalalinjen = 100 µm. (B) at undersøge effekten af PMN-MPs på Colon sår healing i vivo, isolerede PMN-parlamentsmedlemmer blev sprøjtet direkte ind i såret området ved hjælp af en endoskopi-baserede mikroinjektion system (på 24 h post sårede, Colon såret er skitseret med en stiplet linje og injektion nål site er vist med en hvid pil). Såret lukning blev vurderet 3 dage senere (4 dage efter sårede) af endoskopisk billeddannelse. Skalalinjen = 300 µm. (C) 4 dage efter sårede mus blev aflivet og Colon slimhinde sår blev ekstraheret med en saks, indlejret i optimal opskæring temperatur (O.C.T) sammensatte og frosne med flydende kvælstof. Otte mikrometer sektioner af sår var plettet for E-cadherin (grøn) og den nukleare pletten DAPI (blå) til at vurdere omfanget af re epithelialization (øverste paneler) eller for DAPI (blå) og Ki67 (rød) til at visualisere de samlede og prolifererende epitelceller på såret kant (nederste del). Skalalinjen = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokoller til isolering og karakterisering af PMN-afledte hovedplan er beskrevet i denne meddelelse. Flere vigtige kritiske punkter skal tages hensyn til succes af proceduren. Første PMNs isoleret friske og anvendes i eksperimenter inden for 2 h af isolation til at forhindre spontan aktivering og degranulering. Alle håndtering af PMNs under isolation og op til punktet af stimulation skal udføres på isen for at forhindre aktivisering og tidlig MP release12. Andet ultracentrifugering i 1 time eller mere maksimerer pelleringsmidler hovedplanen. tredjedel, analyseres ved flowcytometri, instrumentet skal være korrekt kalibreret med en blanding af instrument-angivet fluorescerende perler (typen perler er justeret til en bestemt instrument) til korrekt define MP størrelser. For eksempel, mens én producent af flow cytometers anbefaler at bruge FSC perler som en størrelse-relaterede parameter, er andre blevet optimeret til VSK perler. Derudover skal flow forskellige anvendes til MP analyse være udstyret med opgraderet elektronik bedst løse parlamentsmedlemmer fra baggrundsstøj.
Til korrekt for at identificere MPs ud over størrelse parametre, anbefales brug af fluorescens farvning som beskrevet i de ovenstående procedurer. Derudover skal alle løsninger i løbet af forberedelse og isolation filtreres gennem en 0,1 µm filtersystem at minimere medtagelsen af støvpartikler eller andre bundfald, der vil øge baggrundsstøjen under erhvervelse ved flowcytometri. Vigtigere, bør betingelser for opbevaring af parlamentsmedlemmer overvejes. Lille beviser8, og vores egen upublicerede observationer, tyder på, at MP frysning fører til membran brud og MP brud. Endelig, varierende PMN aktivering betingelser og timing kan ændre og forbedre MP udbytte.
Der er nogle begrænsninger for denne metode. Isolering af mus PMNs fra knoglemarven er typisk ikke ren (~ 85-90%) og er forurenet med andre immunceller (primært mononukleære lymfocytter), som blev fastsat af flow cytometric analyse. Således, de resulterende isolater kan indeholde små mængder af MPs frigivet af andre immunceller. Alternativer er tilgængelige og omfatter isolation af PMNs af kommercielt tilgængelige magnetiske perler, men dette ville være en længere og en betydeligt dyrere procedure. Endelig, uden fluorescens mærkning, ud over størrelse parametre, endelige differentiering af parlamentsmedlemmer fra støv eller andre opløselige eller luftbårne partikler af lignende størrelser, der kan forurene proeven er udfordrende og fejlbehæftet.
I fremtiden, vil sortering af PMN-MPs mærket med specifikke markører hjælpe belyse MP sammensætning under specifikke stimulerende betingelser eller modeller af sygdom, og forhåbentlig giver mulighed for brug af parlamentsmedlemmer som diagnostisk markører og potentielle terapeutiske mål at behandle inflammatoriske sygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter af nogen art, der er relateret til denne meddelelse
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for den tekniske bistand fra Dr. Suchitra Swaminathan der kører det nordvestlige Feinberg School af medicin Flow flowcytometri kerne. Finansieringen blev leveret af (NIH) DK101675.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning | 10-041-CV | |
| Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) | Atlanta Biologics | S11150 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) | GIBCO | 15140 | |
| 0.5 M EDTA | Fisher | BP2482 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9888 | Sterile and filtered through a 0.1 micron filter unit |
| Sterile filtered Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | |
| Sterile filtered Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Density 1.119 g/ml. Solution of polysucrose and sodium diatrizoate. Bring to room temperature |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium | Cellgro | 210-40-CV | |
| Ethyl Alcohol (200 proof) | Decon labs | 2701 | |
| HBBS | Corning | 21-022-CV | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Sigma | T8154 SIGMA | Diluted 1:2 for cell viability counting |
| Isoflurane | Abbot | 50033 | |
| Anti-human CD11b-APC conjugated | Biolegend | 301350 | Clone ICRD44 (Final concetration: 1 µg/mL) |
| BODIPY FL | Invitrogen | B10250 | N-(2-aminoethyl) maleimide |
| Annexin V Binding Buffer | Biolegend | 422201 | |
| Calibration Beads for Flow Cytometry | BioCytex | 7803 | |
| FITC Annexin V | Biolegend | 640906 | |
| Polymorphprep | Axis-Shield PoC AS | Sodium diatrizoate/Dextran 500, density 1.113 g/ml | |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | ||
| 15 ml centrifuge tubes | Corning | 430053 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 25 ml serological pipettes | Celltreat | 229225B | |
| 10 ml serological pipettes | Celltreat | 229210B | |
| 5 ml serological pipettes | Celltreat | 229205B | |
| Pasteur pipettes | BD Falcon | 357575 | |
| 25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) | BD | 305122 | |
| 100 µm cell strainers | Celltreat | 229485 | |
| Vacutainer tubes | BD | 367251 | |
| Equipment | |||
| LSR Fortessa Special Order Research Product (SORP) | BD | (SORP) | |
| Swinging bucket centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75007210 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | (L8-80 M) | |
| Micro-centrifuge | ThermoFisher Scientific | VV-17703-15 (Fresco 17) | |
| Swinging bucket centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004503 (Megafuge 40R) | |
| Biopsy forceps, 28 cm | Storz | 27071zj | |
| Software | |||
| Image J | National Institute of Health | Open source |
References
- Hickey, M. J., Kubes, P. Intravascular immunity: the host-pathogen encounter in blood vessels. Nat Rev Immunol. 9 (5), 364-375 (2009).
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat Rev Immunol. 6 (3), 173-182 (2006).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (3), 159-175 (2013).
- Butin-Israeli, V., et al. Deposition of microparticles by neutrophils onto inflamed epithelium: a new mechanism to disrupt epithelial intercellular adhesions and promote transepithelial migration. FASEB J. , (2016).
- Gasser, O., Schifferli, J. A. Activated polymorphonuclear neutrophils disseminate anti-inflammatory microparticles by ectocytosis. Blood. 104 (8), 2543-2548 (2004).
- Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. J Vis Exp. (77), e50586 (2013).
- Shet, A. S. Characterizing blood microparticles: technical aspects and challenges. Vasc Health Risk Manag. 4 (4), 769-774 (2008).
- Dey-Hazra, E., et al. Detection of circulating microparticles by flow cytometry: influence of centrifugation, filtration of buffer, and freezing. Vasc Health Risk Manag. 6, 1125-1133 (2010).
- Slater, T. W., et al. Neutrophil Microparticles Deliver Active Myeloperoxidase to Injured Mucosa To Inhibit Epithelial Wound Healing. J Immunol. 198 (7), 2886-2897 (2017).
- Enjeti, A. K., Lincz, L., Seldon, M. Bio-maleimide as a generic stain for detection and quantitation of microparticles. Int J Lab Hematol. 30 (3), 196-199 (2008).
- Headland, S. E., et al. Neutrophil-derived microvesicles enter cartilage and protect the joint in inflammatory arthritis. Sci Transl Med. 7 (315), (2015).
- Andersson, T., Dahlgren, C., Lew, P. D., Stendahl, O. Cell surface expression of fMet-Leu-Phe receptors on human neutrophils. Correlation to changes in the cytosolic free Ca2+ level and action of phorbol myristate acetate. J Clin Invest. 79 (4), 1226-1233 (1987).
