Summary
Nouveaux protocoles sont décrits ici pour isoler et caractériser les microparticules dérivées de l’homme et les neutrophiles de souris. Ces protocoles utilisent l’ultracentrifugation, cytométrie en flux et immunoblotting techniques pour analyser le contenu au moyen de microparticules, et ils peuvent être utilisés pour étudier le rôle de microparticules dérivés de divers types de cellules à fonction cellulaire.
Abstract
Polynucléaires neutrophiles dérivés microparticules (PMN)-MPs) sont bicouche lipidique, microvésicules sphérique avec des tailles allant de 50 à 1 000 nm de diamètre. MPs sont un nouvellement en évolution, une partie importante de la cellule-cellule communication et signalisation machines. En raison de leur taille et la nature de leur libération, existence de MP a été négligé jusqu'à récemment. Cependant, avec une technologie améliorée et des méthodes d’analyse leur rôle dans la santé et la maladie se dessine maintenant. Les protocoles présentés ici visent à isoler et à caractériser les PMN-MPs par immunotransfert et cytométrie en flux. En outre, plusieurs exemples d’application sont donnés. Ces protocoles d’isolement de MP sont rapides, peu coûteux et ne nécessitent pas l’utilisation de kits coûteux. En outre, ils permettent l’étiquetage des députés après isolement, mais aussi de marquage préalable des cellules source avant la sortie de MP, à l’aide d’un colorant fluorescent membranaires spécifiques pour la visualisation et l’analyse par cytométrie en flux. Ces méthodes, cependant, ont plusieurs limitations, y compris la pureté de l’APF et de députés et de la nécessité d’instruments d’analyse sophistiqués. Un cytomètre en flux haut de gamme il faut analyser MPs et de minimiser les fausses lectures positives en raison de bruit ou auto-fluorescence de façon fiable. Les protocoles décrits peuvent servir à isoler et à définir la biogenèse des MP et caractérisent leurs marqueurs et la variation dans la composition sous différentes conditions stimulantes. Hétérogénéité de taille peut être exploitée pour étudier la question de savoir si le contenu de particules de membrane versus exosomes est différent, et si elles jouent des rôles différents dans l’homéostasie tissulaire. Enfin, isolement et caractérisation des députés, leur rôle dans les réponses cellulaires et divers modèles de maladies (y compris, PMN associée à des troubles inflammatoires, telles que les maladies inflammatoires de l’intestin ou la lésion pulmonaire aiguë) suivantes peuvent être explorées.
Introduction
Récemment, « microparticules/microvésicules » provenant du cytosol cellulaire ou de la membrane plasmique sont devenus de grand intérêt scientifique, comme de nouvelles données suggèrent que ces structures, allant de 50-1 000 nm de diamètre, peuvent transporter des données biologiques et servir de méthode de communication cellulaire non canonique. Immunitaire cellules dérivées MPs et particulièrement celles produites par les polynucléaires neutrophiles (PMN) sont d’un grand intérêt, étant donné l’importance de l’APF dans hôte défense1,2, réactions inflammatoires3et cicatrisation 4. Curieusement, jusqu’ici, de nombreux rapports ont montré des fonctions pro-inflammatoires et anti-inflammatoires du PMN-MPs5, suggérant un éventuel contexte - maladie-, espèce- et organe-spécifiques au rôle des députés.
Les protocoles décrits dans la présente communication fournissent une méthode rentable, innovante et adaptable pour étudier la fonction des députés dans la santé et la maladie. Elles s’appliquent à de nombreux organismes modèles, les organes et les conditions de stimulation. Elles permettent d’identifier plusieurs types de MPs et peuvent être utilisés à l’avenir pour traiter leurs fonctions pro-inflammatoires et anti-inflammatoires. Par exemple, décrit ici est de savoir comment étudier la fonction des PMN-MPs dans la plaie épithéliales guérison in vitro et in vivo. Le protocole présenté pour l’isolement de souris APF de moelle osseuse a été adapté avec quelques modifications d’une méthode décrite précédemment6.
En outre, les protocoles décrits dans cette étude permettent pour la détection et la caractérisation de marqueurs spécifiques que l'on retrouve sur PMN-MPs par deux méthodes complémentaires : Western blot et cytométrie en flux. Nous trouvons qu’immunoblotting de députés à l’aide de protocoles standard5 est simple et fiable, cependant, les progrès récents dans la sensibilité des instruments de cytométrie en flux et amélioration du rapport signal-bruit autorisent désormais une analyse plus approfondie des députés en utilisant cette méthode. Les protocoles décrits dans la présente étude incorporent les progrès récents et recommandations émanant des articles de recherche originaux, y compris les modifications apportées à la vitesse de centrifugation et de temps, l’ajout de l’échantillon des conditions de filtrage et surgélation/conservation7 , 8et comment réduire le « bruit de fond », améliorer la limite de détection de PMN-MPs et distinguer les différentes tailles de MPs.
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Protocol
Tous les travaux d’animaux a été approuvé par l’IACUC Nord-Ouest. Toutes les expériences ont été achevées en conformité et le respect de toutes les directives réglementaires et institutionnels. Pour faire un don de sang des sujets humains, un consentement éclairé a été présenté et signé ; en outre, tous les sujets humains dans cette étude ont été traités conformément aux directives institutionnelles et fédérales pour le bien-être de l’humanité.
Remarque : Les étapes du protocole sont répertoriés dans les sous-sections suivantes : (i) l’isolement de cellules de la moelle osseuse de souris ; (ii) isolement de PMN de la moelle osseuse Murine ; (iii) PMN isolement du sang humain ; (iv) MP indépendamment des surnageants PMN (par Ultracentrifugation) ; (v) la caractérisation des députés par Western Blotting ; (vi) la caractérisation des députés par cytométrie de flux ; (viii) l’application des députés isolées d’étude la cicatrisation
1. isolement de cellules de moelle osseuse souris
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Dissection du fémur et du tibia depuis les pattes de la souris
- Préparer une boîte de l’euthanasie (par exemple, une boîte de pointe vide 1 mL) pour l’inhalation de l’anesthésie. Ajouter quelques gouttes d’isoflurane 100 % sur un chiffon stérile collé à l’intérieur d’un couvercle de boîte en plastique. Selon les nouvelles directives IACUC, animaux ne devrait pas entrer en contact direct avec l’isoflurane, donc placer un embout porte entre la souris et la gaze contenant l’isoflurane.
Remarque : L’Isoflurane est un puissant anesthésique par inhalation et doit être manipulé avec une extrême prudence à l’intérieur d’une hotte aspirante. - Euthanasier souris conformément à la recommandation IACUC. Placez une souris à l’intérieur de la boîte de l’euthanasie, décrite à l’étape 1.1.1 pour 1 à 5 min, jusqu'à ce qu’elle a cessé de respirer. S’assurer de la mort de l’animal en effectuant une dislocation cervicale.
- Soulever la peau abdominale à l’aide d’acier inoxydable, 12 cm, courbé, pincettes 0,17 X 0,1 mm et couper la peau à mi-chemin entre les extrémités supérieures et inférieures. Peler la peau d’ici à la section plus distale du corps de souris, y compris les membres inférieurs. Avec 10 cm de long, tout droit ciseaux de dissection, retirez les muscles postérieurs et disloquer l’articulation de la hanche laissant la tête de fémur intact.
- Utiliser des ciseaux à disséquer les muscles du fémur et du tibia et séparer le fémur du tibia. Assurez-vous que les extrémités des os restent intactes, car ils contiennent des quantités importantes de la moelle osseuse.
- Supprimer toute chair restant en faisant rouler l’os à l’intérieur d’une serviette en papier. Placer les os propres dans une boîte de Pétri contenant un milieu sans sérum (GDF, c'est-à-diremoyen de l’aigle de la modification de Dulbecco (DMEM) sans sérum ou antibiotiques).
- Rincer les os dans l’éthanol à 70 %, puis dans la GFD.
- Préparer 50 mL de l’AFD dans un tube conique de 50 mL. Charger les 10 mL de la GDF dans une seringue de 10 mL et l’attacher à une aiguille de calibre 25 et 5/8 po.
- Coupez l’extrémité des os avec des ciseaux jusqu'à ce qu’une ouverture vers la moelle osseuse (couleur rouge) est visible.
- Rincer les cellules de la moelle osseuse dans un nouveau tube de 50 mL. Utiliser une seringue de 10 mL avec une aiguille de calibre 26 et 5/8 po avec environ 3 mL/OS de la GFD. Lorsque vous avez terminé les bouffées de chaleur, remettre en suspension les cellules dans le tube de pipetage (usage jetable 1 mL des pointes en plastique) pour briser les agrégats cellulaires.
- Préparer une boîte de l’euthanasie (par exemple, une boîte de pointe vide 1 mL) pour l’inhalation de l’anesthésie. Ajouter quelques gouttes d’isoflurane 100 % sur un chiffon stérile collé à l’intérieur d’un couvercle de boîte en plastique. Selon les nouvelles directives IACUC, animaux ne devrait pas entrer en contact direct avec l’isoflurane, donc placer un embout porte entre la souris et la gaze contenant l’isoflurane.
2. PMN isolement de murins de la moelle osseuse
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Lyse des globules rouges
- Granulés de la moelle osseuse recueillie par centrifugation à 350 x g pendant 8 min à 4 ° C.
- Resuspendre le culot dans 20 mL de 0,2 % NaCl pour environ 20-30 s à lyser la fraction des érythrocytes. Ne dépassez pas 30 s car cela se traduira par la lyse PMN. Ajouter 20 mL de 1,6 % NaCl pour restaurer l’osmolalité.
Remarque : Cette étape peut conduire à l’activation des PMN très peu. - Laver les cellules avec 2 mL de PBS et centrifuger comme au point 2.1.1 ci-dessus. Retirez le surnageant.
- Procéder à l’isolement APF par centrifugation en gradient de densité.
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Isolement des neutrophiles par centrifugation en gradient de densité
- Chaude polysucrose sodium diatrizoate solutions et, avec des densités de 1,119 g/mL et 1,077 g/mL (voir Table des matières), à température ambiante (RT) avant utilisation.
- Préparer polysucrose et sodium diatrizoate dégradés frais, immédiatement avant la demande de cellules de moelle osseuse en superposant lentement 3 mL de la solution de densité de 1,077 g/mL plus de 3 mL de la solution de densité 1,119 g/mL dans les tubes coniques 15 mL.
Remarque : Préparation de la solution dégradée trop longtemps à l’avance donne au mélange des couches et des pauvre pureté neutrophile et récupération. - Resuspendre le culot de cellules de moelle osseuse dans 1 mL de PBS glacée et la suspension de cellules qui en résultent sur le dessus de la diatrizoate polysucrose et de sodium de superposition dégradé (lentement, pour éviter le mélange des couches).
- Centrifuger pendant 30 min à 850 g à 25 ° C à la droite, sans frein. Conserver les réactifs à RT pour la séparation efficace des neutrophiles des autres cellules présentes dans la moelle osseuse. Définissez la centrifugeuse à décélération lente pour permettre le gradient d’être efficacement formé et maintenu après l’étape de centrifugation.
- Localiser visuellement une couche de cellules mononucléées à l’interface de PBS et 1,077 g/mL de solution de densité (couche supérieure). Enlever cette couche et le reste de la solution de densité sans déranger la bande PMN.
- Recueillir une couche entière de PMN et certains polysucrose sous-jacent et sodium diatrizoate 1,119 g/mL, solution dans des tubes de 15 mL à l’aide d’une pipette de transfert.
Remarque : La pureté de l’APF isolé dépendra un enlèvement complet de la couche supérieure. - Garnir les tubes filtrée PBS (filtré par un filtre de taille de pore de 0,1 µm) et centrifuger à 300 x g pendant 5 min, à 4 ° C.
- Laver le PMN granulés avec 2 mL de PBS à l’aide des conditions de centrifugation comme au point 2.2.7.
- Remettre en suspension dans 1 mL de PBS filtrée et compter l’APF isolé par hémocytomètre.
Remarque : Pour cette méthode d’isolement, la pureté PMN qui en résulte s’élève à ~ 85-90 %, a été évaluée par cytométrie en flux. Les autres fractions de contaminer se composent principalement des lymphocytes mononucléaires.
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Stimulation de PMN pour induire la libération MP
NOTE : PN peut être stimulée pour libérer les députés à l’aide de diverses conditions d’activation, telles que N-formyl-l-methionyl-leucyl-l-phenylalanine (fMLF), phorbol-12-myristate-13-acétate (PMA) ou interféron gamma (IFNγ). Ce qui est important, avant la simulation, APF convient sur la glace en permanence.- Pellet APF (300 x g, 5 min, 4 ° C) et remettre à 0,1 µm filtrée Balanced Salt solution de solution (HBSS) de Hank, contenant l’agent stimulant de choix. Pour une stimulation optimale, utilisez 100 µL de solution de stimulation par PN 10 millions pendant 20-30 min à 37 ° C dans des tubes de 15 mL.
Remarque : Les concentrations suivantes d’activateurs ont été utilisées avec succès dans nos travaux précédents : fMLF (0,5 à 1 µM pour homme et 2 à 5 µM pour les souris APF), PMA (200 nM) et IFNγ (100 ng/mL). Si vous souhaitez la libération des députés préalablement étiquetées, incuber APF non stimulées (1-5 x 106) avec 2′ maléimide-FITC (voir Table des matières) (1 µM dans 100 µL HBSS, 15 min, 37 ° C). Procéder à des mesures 2.3.1-2.3.3. - Tournez en bas à 850 x g pendant 5 min à 4 ° C, pour enlever les PMN et transfert de surnageants acellulaires dans de nouveaux tubes de microcentrifuge de 1,5 mL.
- Pour l’isolation de MP de surnageants acellulaires, passez à l’étape 4.2.
- Pellet APF (300 x g, 5 min, 4 ° C) et remettre à 0,1 µm filtrée Balanced Salt solution de solution (HBSS) de Hank, contenant l’agent stimulant de choix. Pour une stimulation optimale, utilisez 100 µL de solution de stimulation par PN 10 millions pendant 20-30 min à 37 ° C dans des tubes de 15 mL.
3. PMN isolement du sang humain
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Recruter des volontaires sains pour l’extraction de sang selon les directives de la CISR institutionnels.
- Prélever le sang de l’avant-bras d’un volontaire sain dans des tubes contenant du citrate de sodium de commercialement disponible 5 mL (voir Table des matières).
- Pipette 5 mL de solution de diatrizoate de sodium et de dextran (densité de 1,113 g/mL, voir Table des matières) dans des tubes de stérile de 15 mL et, lentement, couche 5 mL de fraîchement isolé sang périphérique humain au-dessus de celui-ci.
- Centrifuger les tubes pendant 50 min à 400 x g à ta (25 ° C) avec une accélération faible et sans frein.
- À la fin de la centrifugation, retirer le plasma et les cellules mononucléées (couche supérieure) à l’aide d’une pipette d’aspiration en plastique stérile.
- Transférer la couche inférieure (PMN) dans un nouveau tube conique stérile de 50 mL.
- Ajouter un volume égal de 0,45 % NaCl à APF (mix bien et doucement en tournant le tube).
- Centrifugation pendant 10 min à 400 g à 25 ° C.
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Lyse des globules rouges
- Ajouter 10 mL d’eau glacée et stérile aux cellules granulés pour 45 s puis 10 mL de glacee stérile 1,8 % NaCl pour restaurer l’osmolalité.
Remarque : Toutes les étapes suivantes pour l’isolement de PMN doivent être effectuées sur la glace pour éviter l’activation PMN et libération prématurée de MP. L’étape de lyse elle-même entraîne l’activation de PMN mineure mais non significative, cependant, il est essentiel d’isoler une population PMN pure pour les tests fonctionnels. - Centrifuger les cellules pendant 10 min à 250 x g à 4 ° C, avec une décélération douce.
- Répétez les étapes 3.2.1 et 3.2.2.
- Resuspendre PMNs dans 5 mL de HBSS glacee sans calcium ou de magnésium. Compter les cellules vivantes totales (utiliser un hémocytomètre et la viabilité à la dilution 1 / 2, voir la Table des matières) avant la stimulation.
Remarque : APF isolé devrait servir de stimulation ou d’autres expériences après 2 h d’isolement afin d’éviter des changements fonctionnels et cellulaires et la mort cellulaire.
- Ajouter 10 mL d’eau glacée et stérile aux cellules granulés pour 45 s puis 10 mL de glacee stérile 1,8 % NaCl pour restaurer l’osmolalité.
4. MP isolement de surnageants PMN activés
Remarque : Un protocole similaire est utilisé pour l’isolement de parlementaires de l’APF murins et humains.
- Pellet APF (300 x g, 5 min, 4 ° C) et remettre à 0,1 µm filtré la solution HBSS, contenant l’agent stimulant de choix (pour exemple 1 µM fMLF, voir Note : 2.3.1). Pour une stimulation optimale utilisez 100 µL de solution de stimulation par PN 10 millions pendant 20-30 min à 37 ° C dans des tubes de 15 mL.
- Après la stimulation, tournez en bas activé APF à 600 x g pendant 5 min à 4 ° C et transfert de surnageants acellulaires dans de nouveaux tubes de microcentrifuge de 1,5 mL.
- Centrifuger le surnageant PMN affranchis à 13 000 x g, 10 min, 4 ° C pour éliminer les débris cellulaires et transférer le surnageant déboisée dans un nouveau tube ultracentrifugeuse.
- Centrifuger pendant 1 h à 100 000 x g, à 4 ° C. Supprimer les surnageants avant stockage MP. Au besoin, magasin granulées MPs en paraffine scellé tubes ultracentrifugeuse à-80 ° C jusqu'à l’utilisation dans des expériences.
5. examen des PMN-MPs Western Blot
- Ajouter 1 % SDS tampon (50-200 µL avec 100 mM de Tris pH : 7,4) aux députés pellet (de l’étape 4.4), transfert dans de nouveaux tubes de microcentrifuge de 1,5 mL et faire bouillir les députés lysées pendant 5 min.
Remarque : Le nombre des députés et le volume de tampon de lyse doit être ajusté et optimisé pour chaque protéine d’intérêt. -
Charger une quantité égale de PMN-MPs par couloir en chargement tampon contenant du β-mercapto-éthanol à 10 %.
Remarque : Avec notre méthode, nous chargeons les députés qui ont été isolées chez le même nombre de PN stimulée.- Séparer les lysats par SDS-PAGE sur gel de polyacrylamide 10 % (utiliser 50-100 V pour 1 à 1,5 h) et le transfert des protéines totales sur des membranes de nitrocellulose comme décrit9.
- Bloquer les membranes pendant 1 h avec lait écrémé 5 % à 0,05 % Tween-20 tampon Tris salin et incuber il avec un primaire approprié (une nuit à 4 ° C), suivie par l’anticorps conjugué HRP secondaires.
- Visualiser les bandes en ajoutant chemoluminescence solution à la membrane et l’exposition à une radiographie à l’intérieur d’une cassette opaque (1-24h).
6. examen des PMN-MPs par cytométrie en flux
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Pour la coloration d’anticorps, diluer anticorps convenablement dans le tampon de FACS (PBS avec EDTA, 0,1 % d’azide de sodium à 0,1 mM). Remettre granulées PMN-MPs (dérivé de 1-3 x 106 PN/condition) dans 100 µL de solution d’anticorps.
- Si la coloration pour l’annexine V, resuspendre granulées PMN-MPs dans un tampon d’annexine V contenant 5 µL de conjugué FITC annexine V. Si la coloration conjointement avec des anticorps, ajoutez l’anticorps désirés (pour un exemple, voir Table des matières) directement à la solution de l’annexine V. Ajouter le colorant fluorescent lipide, 2′ maléimide (voir Table des matières), à la concentration de 1 µM dans 100 µL de tampon de FACS d’étiqueter et d’identifier les MPs.
- Incuber les députés de la coloration de la solution pendant au moins 20 min à 4 ° C.
- Laver les députés par ultracentrifugation (1 h à 100 000 x g, à 4 ° C) ; jeter le surnageant.
- Remettre en suspension dans un tampon FACS et exécuter les exemples sur un cytomètre désigné équipé d’une unité électronique améliorée pour une sensibilité accrue (voir Table des matières).
7. les demandes d’isolé PMN-MPs à étudier la fonction PMN dans la cicatrisation des plaies
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In vivo administration PMN-MPs aux plaies du côlon
- Anesthésier souris par injection intrapéritonéale d’un mélange de kétamine (100 mg/kg) et de xylazine (5 mg/kg). Confirmer l’anesthésie par pédale réflexe (pincement de l’orteil ferme) et ajuster au besoin.
- Placez la souris sur son ventre et à l’aide de pinces à biopsie de 28 cm et un endoscope équipé d’une caméra à haute résolution (par exemple un endoscope vétérinaire pour petits animaux utilisés, voir la Table des matières), générer des plaies superficielles de 3-5 le long de la face dorsale de la deux points. Au terme de blessant, retour de souris à une cage placée sur un tapis de contrôle de la température (37 ° C) jusqu'à guérison.
- Anesthésier la souris (comme au point 7.1.1). Utiliser un endoscope pour acquérir des images de blessures infligées après blessant 24 h (jour 1). Laisse les souris à récupérer comme au point 7.1.2.
- En même temps (24h après blessure), administrer murines PMN-MPs dérivés de 2 x 106 PMNs dans 100 µL de HBSS + directement dans chaque site de la plaie à l’aide d’une microinjection axée sur la coloscopie système (utilisez une aiguille de 29 G)9. Trois jours plus tard (jour 4 après blessure) offrir une souris (comme au point 7.1.1) et utilise un endoscope pour réacquérir les images de la guérison des plaies. Laisse les souris à récupérer comme au point 7.1.2.
- À l’aide de logiciels d’analyse image préférée régions en mode plan visible plaie (voir Table des matières), dans les images acquises, mesure de la zone de la même blessure aux jours 1 et 4 post-blessant et calculer le pourcentage de fermeture de la plaie.
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Les cellules épithéliales humaines in vitro la cicatrisation des plaies
- BBe Caco-2 comte ou T84, les cellules épithéliales intestinales humaines par hémocytomètre et semences 5 x 105 cellules/puits dans les plaques 24 puits culture. Incuber les cellules dans une chambre standard d’incubation à 37 ° C et 5 % de CO2. Caco-2 BBe ou T84 atteignent confluence dans 48 h9. Pour la culture de cellules épithéliales, utilisez DMEM et DMEM-F12 (50/50) avec des suppléments comme précédemment décrit9.
- Générer des plaies de grattage mécaniques dans la monocouche à l’aide d’un embout de la pipette et succion faible comme décrit précédemment,4,9. Acquérir des images des zones de la plaie immédiatement après grattage à l’aide d’un microscope à contraste de phase inversée interférentiel différentiel (objectifs d’utilisation 5 X ou 10 X), pour être utilisé comme un temps = point de référence 0.
- MPs (dérivés du 2-4 X 106 PMNs) s’ajoute les monocouches de cellules épithéliales rayé-blessé et incuber pendant 24 h supplémentaires (48 h après blessure, à 37 ° C, avec 5 % de CO2). En ce moment ré-acquisition d’images de zéro-plaies.
- Utilisez le logiciel d’analyse image préférée (voir Table des matières) pour mesurer des plaies à t = 0 et t = 48 h. calculer le pourcentage de fermeture de la plaie en déterminant la différence dans la région de la plaie aux points de temps choisi.
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Representative Results
Cytométrie représentant des députés qui ont été isolés des humains et de souris APF sont indiquées à la Figure 1. L’hétérogénéité de taille de PMN-MPs peut être n’évaluée par comparaison à des perles de tailles connues comme illustré à la Figure 1A, B pour humain MPs. Note, aucune différence significative dans l’hétérogénéité de taille ont été observés entre la souris et les humains MPs. De même, à l’aide de cytométrie en flux et étiquetage de la fluorescence, expression de la protéine/s de choix par les députés isolées de souris ou d’origine humaine peut être déterminée. Par exemple, l’expression de la Phosphatidyl sérine (PhS) peut être examinée par l’annexine V coloration. Murin de moelle osseuse PMN-MPs sont indiquées dans la Figure 1C, D. Expression de plusieurs marqueurs de choix peut également être évaluée comme indiqué pour l’annexine V et CD11b souillure humaine MPS, Figure 2A, B. Une autre méthode pour détecter les PMN-MPs par cytométrie en flux est pour colorer les PMN fraîchement isolés avant la stimulation, comme illustré à la Figure 2C. Par exemple, PMN coloration avec le marqueur de lipides 2′ maléimide-FITC avant fMLF résultats de stimulation de la libération des députés vertes, qui peuvent être facilement détectées par flux. À noter, alors que la coloration à 2′ maléimide-FITC a servi antérieurement d’étiqueter et de détecter les députés qui ont été obtenues à partir du sang périphérique humain10 ou injectées dans des animaux11, l’utilisation d’autres marqueurs pour l’étiquetage à des fins application in vitro ou in vivo doit être déterminée par chaque chercheur. En plus de la cytométrie en flux, PMN-MPs peuvent être analysés par immunotransfert des protéines d’intérêt. Comme illustré à la Figure 3, MPs, dérivés de PMN humaine qui ont été stimulées avec plusieurs activateurs connus, ont été examinés pour l’expression de clé inflammatoire (matrice metallopeptidase 9 (MMP-9) et contre la myéloperoxydase (MPO)) et anti-inflammatoire (annexine A1) molécules. Comme le montre de représentant par immunoblot, stimulation PMN avec IFNγ (50 ng/mL), PMA (200 nM), et fMLF (1 µM) a donné lieu à des députés exprimant des niveaux variables de MMP-9. Cependant, la seule perturbation du cytosquelette d’actine par l’avant de la Latrunculine B (1 µM) à une stimulation par fMLF (5 µM) conduit à la présence abondante de MPO dans PMN-MPs. De même, des niveaux variables d’annexine A1 (élevé à aucune détection) ont été détectés sur MPs suivant les conditions d’activation décrites. Ces résultats suggèrent que la composition de PMN-MP est dépendant de stimulus.
Enfin, Figure 4 montre comment PMN-MPs isolés peuvent être utilisés pour étudier les plaie guérison in vitro et in vivo des blessures du côlon. PMN-MPs peuvent être ajoutés aux monocouches épithéliales blessés de zéro dans les cultures, où la guérison peut être surveillée par imaging acquisition à des moments prédéterminés. MPs peuvent encore être micro directement dans les plaies du côlon, générés par les pinces à biopsie et d’imagerie endoscopique9, et leur effet sur la guérison peut être évaluée. Pour l’analyse in vitro et in vivo de la cicatrisation des plaies, les images des suites de blessures infligées sont acquises immédiatement post blessant (ou non spécifié) et continuellement à travers le processus de guérison à des moments prédéterminés. À l’aide de logiciels d’analyse image disponible dans le commerce, les changements dans la région de la plaie (taille) sont mesurées et utilisées pour déterminer le taux de fermeture de plaie. Application du PMN-MPs qui contiennent le MPO soit cultivées monocouches épithéliales ou in vivo sur les plaies du côlon a des effets préjudiciables, conduisant à la guérison retardée9.
Figure 1 . Analyse de la taille de PMN-MP et de marqueurs de surface par cytométrie. (A) cytomètre en flux optimisé perles de contrôle (voir Table des matières) de tailles connues et des valeurs de dispersion sont indiqués dans la représentation orthogonale SSC et FSC. Les perles sont utilisées pour obtenir une comparaison de taille relative auprès d’un échantillon de PMN-MP montre B. (B) humaine PMN-MPs ont été isolés et analysés par cytométrie en flux, en utilisant des conditions décrites pour les perles. L’hétérogénéité dans les tailles de MP sont visibles. (C–D) Députés de stimulée par fMLF murin la moelle osseuse Qu'apf ont été analysés par cytométrie en flux. Représentatif des diagrammes de flux montrent non-colorées (C) ou annexine V-FITC teinté (D) MPs. zone rectangulaire montre Annexin V positif MPs (MPs FITC-positif). SSC : Side Scatter ; FSC : Forward Scatter ; PhS : Phosphatidylsérine. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . Coloration de PMN-MP et l’analyse par cytométrie. Zone Unstained (A) et (B) Annexin V-FITC et hCD11b-APC-teinté MPs. Square renferme une population positive double annexine V/CD11b de PMN-MPs. (C) fraîchement isolées humaine APF (1 x 106) ont été colorés avec un colorant fluorescent , 2′ maléimide-FITC et stimulés par fMLF. MPs ont été isolés dans les surnageants de cellule et analysés par cytométrie en flux. Zone rectangulaire renferme une population de MP positive de 2′ maléimide-FITC (M-FITC, étiquette de l’axe des ordonnées). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 . Composition du PMN-MPs dépend de l’impulsion. (A) humaine APF ont été stimulées avec IFNγ, TNFα, fMLF, PMA ou une combinaison de latranculin B suivie fMLF (LtB-fMLF). MPs ont été isolés chez les surnageants de cellules qui en résultent par ultracentrifugation et lysats de protéines ont été préparées dans un tampon 1 % SDS. Protéines ont été séparées par taille par électrophorèse dans un gel de polyacrylamide 10 %, transférés sur une membrane de nitrocellulose et sondés pour un MMP-9, MPO ou annexine A1 anticorps primaire suivie d’anticorps secondaires conjugué HRP appropriés. (B) microscopie représentant images de PMN-MPs humaines représentent la taille hétérogénéité. L’exosome < 100 nm de taille est indiqué par la flèche blanche. Echelle = 250 nm (panneaux gauche et droit). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : L’utilisationdes isolés PMN-MPs à étudier le rôle de l’APF dans épithéliales cicatrisation. BBe de Caco-2 (A) les cellules épithéliales intestinales humaines ont été plaqués confluency, scratch-blessé et soumis aux députés provenant de PMN 3 millions, qui ont été ajoutés immédiatement après la blessure. Images représentatives montrent fermeture de la plaie (48 h après blessure) dans le contrôle (panneaux de gauche) et les cellules épithéliales traités PMN-MP (panneaux de droite). Echelle = 100 µm. (B) pour examiner l’effet du PMN-MPs sur colique plaie guérison en vivo, PMN-députés isolés ont été injectées directement dans la région de la plaie à l’aide d’un système de micro-injection axée sur l’endoscopie (à 24h après blessure, la plaie colique est souligné par une ligne en pointillés et l’injection site aiguille est indiqué par une flèche blanche). Fermeture de la plaie a été évaluée à 3 jours plus tard (4 jours après blessure) par imagerie endoscopique. Echelle = 300 µm. (C) 4 jours après blessure de souris ont été euthanasiés plaies muqueuses coliques ont été extrait et avec des ciseaux, incorporés dans le composé de température (O.C.T) de coupe optimale gelés à l’azote liquide. Sections de micromètre huit des plaies ont été colorées pour la E-cadhérine (vert) et de la coloration nucléaire DAPI (bleu) évaluer le niveau de réépithélialisation (panneaux supérieurs), ou pour DAPI (bleu) et Ki67 (rouge) visualiser les totales et prolifération des cellules épithéliales à le bord de la plaie (panneaux inférieurs). Echelle = 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Protocoles d’isolement et caractérisation de dérivés de PMN MPs sont décrites dans la présente communication. Plusieurs points clés de la critique doit être tenus compte pour la réussite de la procédure. Tout d’abord, PMN doit être isolé frais et utilisé dans des expériences après 2 h d’isolement pour éviter la dégranulation et une activation spontanée. Toute manipulation des APF lors de l’isolation et jusqu’au moment de la stimulation doit être effectuée sur la glace pour prévenir l’activation et prématurée MP version12. Deuxièmement, ultracentrifugation pendant 1 h ou plus maximise la granulation des MPs. troisième, pour l’analyse par cytométrie en flux, l’appareil doit être correctement étalonné avec un mélange de perles fluorescentes spécifié par l’instrument (le type de perles est ajusté à un particulier instrument) de définir correctement les tailles de MP. Par exemple, alors qu’un fabricant de cytomètres recommande d’utiliser des perles de FSC comme un paramètre de taille, d’autres ont été optimisés pour les perles de la SSC. En outre, le cytomètre en flux à utiliser pour l’analyse de la MP doit être équipé électronique améliorée pour mieux résoudre les députés du bruit de fond.
D’identifier correctement les MPs en plus des paramètres de taille, l’utilisation de la fluorescence coloration comme décrit dans la procédure ci-dessus est fortement recommandée. En outre, toutes les solutions au cours de la préparation et l’isolement doivent être filtrées par un système de filtre 0,1 µm pour minimiser l’inclusion de particules de poussière ou autres précipités qui vont augmenter le bruit de fond lors de l’acquisition par cytométrie en flux. Ce qui est important, les conditions de stockage des députés devraient considérer. Petite preuve8et nos propres observations non publiées, suggèrent que MP gel conduit à la rupture des membranes et des bris de MP. Enfin, différentes conditions d’activation de PMN et le calendrier peuvent changer et améliorer le rendement de la MP.
Il y a certaines limites à cette méthode. Isolement des souris APF de la moelle osseuse n’est généralement pas pure (~ 85-90 %) et est contaminée par d’autres cellules immunitaires (principalement les lymphocytes mononucléaires) a été déterminée par analyse en cytométrie en flux. Ainsi, les isolats qui en résulte peuvent inclure de petites quantités de députés libérées par d’autres cellules immunitaires. Des solutions de rechange sont disponibles et comprennent l’isolement de l’APF de billes magnétiques disponibles dans le commerce, cependant, ce serait un plus long et une procédure beaucoup plus coûteuse. Enfin, sans fluorescence d’étiquetage, en plus des paramètres de la taille, la différenciation définitive des députés de la poussière ou autres particules solubles ou aéroportées de tailles similaires qui peuvent contaminer l’échantillon est difficile et sujette à erreur.
Tri des PMN-MPs marquées avec des marqueurs spécifiques à l’avenir, va aider élucider composition MP sous des conditions spécifiques de stimulation ou de modèles de la maladie et j’espère que permettre l’utilisation des députés comme marqueurs diagnostiques et cibles thérapeutiques potentielles pour traiter maladies inflammatoires.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts quelconques liés à cette communication
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants pour l’assistance technique du Dr Suchitra Swaminathan qui dirige le noyau Northwestern Feinberg School de médecine Flow Cytometry. Financé par la DK101675 (NIH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning | 10-041-CV | |
| Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) | Atlanta Biologics | S11150 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) | GIBCO | 15140 | |
| 0.5 M EDTA | Fisher | BP2482 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9888 | Sterile and filtered through a 0.1 micron filter unit |
| Sterile filtered Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | |
| Sterile filtered Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Density 1.119 g/ml. Solution of polysucrose and sodium diatrizoate. Bring to room temperature |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium | Cellgro | 210-40-CV | |
| Ethyl Alcohol (200 proof) | Decon labs | 2701 | |
| HBBS | Corning | 21-022-CV | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Sigma | T8154 SIGMA | Diluted 1:2 for cell viability counting |
| Isoflurane | Abbot | 50033 | |
| Anti-human CD11b-APC conjugated | Biolegend | 301350 | Clone ICRD44 (Final concetration: 1 µg/mL) |
| BODIPY FL | Invitrogen | B10250 | N-(2-aminoethyl) maleimide |
| Annexin V Binding Buffer | Biolegend | 422201 | |
| Calibration Beads for Flow Cytometry | BioCytex | 7803 | |
| FITC Annexin V | Biolegend | 640906 | |
| Polymorphprep | Axis-Shield PoC AS | Sodium diatrizoate/Dextran 500, density 1.113 g/ml | |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | ||
| 15 ml centrifuge tubes | Corning | 430053 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 25 ml serological pipettes | Celltreat | 229225B | |
| 10 ml serological pipettes | Celltreat | 229210B | |
| 5 ml serological pipettes | Celltreat | 229205B | |
| Pasteur pipettes | BD Falcon | 357575 | |
| 25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) | BD | 305122 | |
| 100 µm cell strainers | Celltreat | 229485 | |
| Vacutainer tubes | BD | 367251 | |
| Equipment | |||
| LSR Fortessa Special Order Research Product (SORP) | BD | (SORP) | |
| Swinging bucket centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75007210 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | (L8-80 M) | |
| Micro-centrifuge | ThermoFisher Scientific | VV-17703-15 (Fresco 17) | |
| Swinging bucket centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004503 (Megafuge 40R) | |
| Biopsy forceps, 28 cm | Storz | 27071zj | |
| Software | |||
| Image J | National Institute of Health | Open source |
References
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