Summary
Nuovi protocolli sono descritti qui per isolare e caratterizzare microparticelle derivate dall'essere umano e del mouse neutrofili. Questi protocolli utilizzano ultracentrifugazione, citometria a flusso e tecniche di immunoblotting per analizzare il contenuto di microparticelle, e sono utilizzabili per studiare il ruolo delle microparticelle derivate da vari tipi di cellule nella funzione cellulare.
Abstract
Microparticelle neutrofili polimorfonucleate (PMN)-MPs) sono il doppio strato lipidico, microvescicole sferica con dimensioni che vanno da 50 – 1.000 nm di diametro. M/s sono una nuova evoluzione, parte importante della comunicazione cellula-cellula e segnalazione macchine. A causa della loro dimensione e la natura del loro rilascio, fino a poco tempo esistenza MP è stato trascurato. Tuttavia, con la migliore tecnologia e metodi analitici sta emergendo la loro funzione nella salute e nella malattia. I protocolli qui presentati mirano a isolare e caratterizzare PMN-MPs di immunoblotting e citometria a flusso. Inoltre, diversi esempi di implementazione sono dati. Questi protocolli per l'isolamento di MP sono veloci, basso costo e non richiedono l'uso di costosi Kit. Inoltre, essi consentono l'etichettatura di MPs dopo isolamento, così come pre-etichettatura delle cellule di origine prima del rilascio di MP, utilizzando un colorante fluorescente di membrana specifici per la visualizzazione e l'analisi di citometria a flusso. Questi metodi, tuttavia, hanno diverse limitazioni tra cui purezza di PMNs e MPs e la necessità di sofisticata strumentazione analitica. Un citometro a flusso High-end è necessario analizzare MPs e minimizzare letture false positive a causa di rumore o auto-fluorescenza in modo affidabile. I protocolli descritti possono essere utilizzati per isolare e definire la biogenesi di MP e caratterizzano i loro marcatori e variazione nella composizione sotto diverse condizioni stimolanti. Eterogeneità di dimensioni può essere sfruttata per indagare se il contenuto di particelle della membrana contro esosomi è diverso, e se essi soddisfano diversi ruoli nell'omeostasi del tessuto. Infine, può essere esplorate seguente isolamento e caratterizzazione di MPs, la loro funzione in risposte cellulari e vari modelli di malattia (tra cui, PMN-collegata di disordini infiammatori, quali le malattie infiammatorie intestinali o ferita acuta del polmone).
Introduction
Recentemente, "microparticelle/microvescicole" provenienti dal cytosol delle cellule o della membrana plasmatica sono diventati di grande interesse scientifico, come i dati emergenti suggeriscono che queste strutture, che vanno da 50-1.000 nm di diametro, possono trasportare informazioni biologiche e servire come un metodo non-canonica di comunicazione cellulare. Immunitario cellule derivate MPs e specialmente quelli prodotti dai neutrofili polimorfonucleari (PMNs) sono di grande interesse, dato l'importante ruolo di PMNs in host defense1,2, le risposte infiammatorie3e guarigione 4. intrigante, finora, numerose segnalazioni hanno dimostrato sia pro-infiammatorie e anti-infiammatori funzioni di PMN-MPs5, suggerendo un potenziale contesto - malattia-, specie- e ruolo di organo-specific di MPs.
Protocolli descritti nella presente comunicazione forniscono un metodo conveniente, innovativo e adattabile per studiare la funzione di MPs nella salute e nella malattia. Sono applicabili a molti organismi modello, organi e condizioni di stimolazione. Essi consentono l'identificazione di diversi tipi di MPs e può essere utilizzati in futuro per affrontare le loro funzioni pro-infiammatorie e anti-infiammatori. Ad esempio, descritto qui è come studiare la funzione di PMN-MPs in arrotolata epiteliale guarigione in vitro e in vivo. Il protocollo presentato per l'isolamento del mouse PMNs derivate da midollo osseo è stato adattato con alcune modifiche da un metodo descritto in precedenza6.
Inoltre, protocolli descritti in questo studio consentono l'individuazione e la caratterizzazione di marcatori specifici che possono essere trovati su PMN-MPs con due metodi complementari: Western blot e citometria a flusso. Troviamo che immunoblotting di MPs utilizzando protocolli standard5 è semplice e affidabile, tuttavia, i recenti progressi nella sensibilità di flusso cytometry strumenti e una migliore rapporto segnale-rumore ora consentono per ulteriori analisi di MPs utilizzando questo metodo. Incorporano i protocolli descritti in questo studio gli avanzamenti recenti e consigli da articoli di ricerca originale, incluse le modifiche alla velocità di centrifugazione e ora, l'aggiunta dell'esempio filtraggio e congelamento/conservazione condizioni7 , 8e come ridurre il "rumore di fondo", migliorare il limite di rilevamento di PMN-MPs e discriminare tra diverse dimensioni di MPs.
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Protocol
Tutto il lavoro animale fu approvato il IACUC nord-occidentale. Tutti gli esperimenti sono stati completati in conformità e rispetto di tutti i pertinenti orientamenti normativi e istituzionali. Per soggetti umani donazione di sangue, un consenso informato è stato presentato e firmato; Inoltre, tutti i soggetti umani in questo studio sono stati trattati in conformità con le linee guida istituzionali e federale per il benessere umano.
Nota: La procedura di protocollo sono elencati sotto le sottosezioni seguenti: (i) isolamento delle cellule del midollo osseo del Mouse; (ii) PMN isolamento da midollo osseo murino; (iii) PMN isolamento da sangue umano; (iv) MP isolamento da surnatanti PMN (dall'ultracentrifugazione); (v) caratterizzazione di MPs mediante Western Blotting; (vi) caratterizzazione di MPs da citometria a flusso; (viii) l'applicazione di MPs isolato per la guarigione della ferita di studio
1. isolamento delle cellule del midollo osseo Mouse
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Dissezione del femore e della tibia da piedini posteriori del mouse
- Preparare una scatola di eutanasia (ad esempio, una casella di punta vuota 1 mL) per inalazione dell'anestesia. Aggiungere poche gocce di isoflurane 100% su un panno sterile registrato all'interno di un coperchio di scatola di plastica. Secondo le nuove linee guida IACUC, animali non dovrebbe entrare in contatto diretto con isoflurano, così posto un titolare di punta tra il mouse e la garza contenente l'isoflurano.
Nota: Isoflurane è un potente anestetico da inalazione e devono essere maneggiate con estrema cautela all'interno di una cappa aspirante. - Eutanasia topi secondo la raccomandazione IACUC. Posizionare un mouse all'interno della scatola di eutanasia descritta al punto 1.1.1 per 1 – 5 min fino a quando non ha smesso di respirare. Garantire la morte dell'animale eseguendo una dislocazione cervicale.
- Sollevare la pelle addominale utilizzando acciaio inox, 12 cm curvata, pinzette 0,17 X 0,1 mm e tagliare la pelle a metà strada tra l'estremità superiore e inferiore. La buccia da qui alla sezione più distale del corpo del mouse compreso le estremità più basse. Con 10 cm di lunghezza, dritto di dissezione Forbici, rimuovere i muscoli dalle zampe posteriori e dislocare l'articolazione dell'anca, lasciando intatta la testa del femore.
- Usare le forbici per sezionare i muscoli dal femore e la tibia e separare il femore, dalla tibia. Assicurarsi che le estremità delle ossa rimangono intatte, in quanto contengono quantità significative di midollo osseo.
- Rimuovere tutta la carne rimanente facendo rotolare le ossa all'interno di un tovagliolo di carta. Posizionare le ossa pulite in una piastra Petri contenente Medium senza siero (SFM, cioè, esente per volta Eagle di Dulbecco (DMEM) senza siero o antibiotici).
- Sciacquare le ossa in etanolo al 70% e poi in SFM.
- Preparare 50 mL di SFM in una provetta conica da 50 mL. Caricare 10 mL di SFM in una siringa da 10 mL e allegarlo a un ago di calibro 25 e 5/8 di pollice.
- Tagliare le estremità delle ossa con le forbici, fino a un'apertura al midollo osseo (colore rossastro) è visibile.
- Lavare le cellule del midollo osseo in una nuova provetta da 50 mL. Utilizzare una siringa da 10 mL con un ago di calibro 26 e 5/8 di pollice con circa 3 mL/osso di SFM. Al termine di vampate di calore, risospendere le cellule nel tubo pipettando (punte di plastica monouso da 1 mL uso) per rompere aggregati cellulari.
- Preparare una scatola di eutanasia (ad esempio, una casella di punta vuota 1 mL) per inalazione dell'anestesia. Aggiungere poche gocce di isoflurane 100% su un panno sterile registrato all'interno di un coperchio di scatola di plastica. Secondo le nuove linee guida IACUC, animali non dovrebbe entrare in contatto diretto con isoflurano, così posto un titolare di punta tra il mouse e la garza contenente l'isoflurano.
2. PMN isolamento dal midollo osseo murino
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Lisi delle cellule rosse
- Pellet di midollo osseo raccolto mediante centrifugazione a 350 x g per 8 min a 4 ° C.
- Risospendere il pellet cellulare in 20 mL di 0,2% NaCl per circa 20-30 s a lisare la frazione dell'eritrocito. Non superare 30 s come questo si tradurrà nella lisi PMN. Aggiungere 20 mL di 1,6% NaCl per ripristinare osmolalità.
Nota: Questo passaggio può portare all'attivazione di PMN molto poco. - Lavare le cellule con 2 mL di PBS e centrifugare come descritto al punto 2.1.1 sopra. Eliminare il surnatante.
- Procedere alla separazione PMNs centrifugazione in gradiente di densità.
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Isolamento dei neutrofili di centrifugazione in gradiente di densità
- Caldo polysucrose e sodio diatrizoate soluzioni, con densità di 1,119 g/mL e 1,077 g/mL (Vedi Tabella materiali), a temperatura ambiente (TA) prima dell'uso.
- Preparare polysucrose e sodium diatrizoate gradienti freschi, immediatamente prima dell'applicazione delle cellule del midollo osseo di stratificazione lentamente 3 mL di soluzione densità 1,077 g/mL oltre 3 mL di soluzione di densità 1,119 g/mL in provette coniche da 15 mL.
Nota: La preparazione della soluzione gradiente troppo lontano in anticipo si tradurrà in miscelazione degli strati e scarsa purezza del neutrofilo e recupero. - Risospendere il pellet di cellule del midollo osseo in 1 mL di PBS ghiacciata e la sospensione cellulare risultante in cima il diatrizoate polysucrose e sodio di sovrapposizione sfumatura (lentamente, per evitare la miscelazione degli strati).
- Centrifuga per 30 min a 850 x g a 25 ° C a RT, senza freno. Conservare i reagenti a RT per separazione effettiva dei neutrofili dalle altre cellule presenti nel midollo osseo. Impostare la centrifuga in decelerazione lenta per consentire il gradiente deve essere efficiente formata e mantenuta dopo la fase di centrifugazione.
- Localizzare visivamente uno strato di cellule mononucleari all'interfaccia di PBS e soluzione di densità 1,077 g/mL (livello superiore). Rimuovere questo strato e il resto della soluzione densità senza disturbare la band PMN.
- Raccogliere un intero livello PMN e alcune delle polysucrose sottostante e soluzione di sodio diatrizoate 1,119 g/mL in provette da 15 mL utilizzando una pipetta di trasferimento.
Nota: La purezza dell'isolato PMNs dipenderà una rimozione completa dello strato superiore. - Home page i tubi con filtrata PBS (filtrata attraverso un filtro di dimensione dei pori di 0.1 µm) e centrifugare a 300 x g per 5 min a 4 ° C.
- Lavare il pellettato PMNs con 2 mL di PBS utilizzando le condizioni di centrifugazione come descritto al punto 2.2.7.
- Risospendere in 1 mL di PBS filtrata e contare i PMNs isolato di un emocitometro.
Nota: Per questo metodo di isolamento, la purezza PMN risultante ammonta a ~ 85-90%, come è stata valutata da citometria a flusso. Il restante contaminando le frazioni costituita principalmente da linfociti mononucleari.
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Stimolazione di PMN di indurre il rilascio di MP
Nota: PMNs possono essere stimolate a rilasciare MPs utilizzando varie condizioni d'attivazione, tra cui N-formyl-l-methionyl-leucyl-l-phenylalanine (fMLF), phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA) o interferone gamma (IFNγ). Importante, prima della simulazione, PMNs dovrebbero essere tenuti su ghiaccio in ogni momento.- PMNs pellet (300 x g, 5 min, 4 ° C) e risospendere in 0,1 µm filtrata soluzione soluzione (HBSS) salina bilanciata di Hank, contenente l'agente stimolante della scelta. Per stimolazione ottima, utilizzare 100 µ l di soluzione di stimolazione per 10 milioni PMNs per 20-30 min a 37 ° C in provette da 15 mL.
Nota: Le seguenti concentrazioni di attivatori sono state utilizzate con successo nel nostro lavoro precedente: fMLF (0,5-1 µM per umani e 2-5 µM per mouse PMNs), PMA (200 nM) e IFNγ (100 ng/mL). Se è previsto il rilascio di MPs pre-etichettata, incubare PMNs non stimolate (1-5 x 106) con N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC (Vedi Tabella materiali) (1 µM 100 µ l HBSS, 15 min, 37 ° C). Procedere con la procedura 2.3.1-2.3.3. - Rotazione verso il basso a 850 x g per 5 min a 4 ° C, per rimuovere PMNs e trasferire senza cellula surnatanti a nuovo per microcentrifuga da 1,5 mL.
- Per l'isolamento di MP da surnatanti senza cellula, continuare al punto 4.2.
- PMNs pellet (300 x g, 5 min, 4 ° C) e risospendere in 0,1 µm filtrata soluzione soluzione (HBSS) salina bilanciata di Hank, contenente l'agente stimolante della scelta. Per stimolazione ottima, utilizzare 100 µ l di soluzione di stimolazione per 10 milioni PMNs per 20-30 min a 37 ° C in provette da 15 mL.
3. PMN isolamento da sangue umano
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Reclutare volontari sani per l'estrazione di sangue secondo le linee guida istituzionali IRB.
- Raccogliere il sangue dall'avambraccio di un volontario sano nelle provette contenenti citrato di sodio a 5ml commercialmente disponibili (Vedi Tabella materiali).
- Pipettare 5 mL della soluzione di diatrizoate destrano e sodio (densità 1,113 g/ml, Vedi Tabella materiali) in provette sterili da 15 mL e lentamente strato 5 mL di sangue periferico umano appena isolato in cima esso.
- Centrifugare le provette per 50 min a 400 x g a temperatura ambiente (25 ° C) con bassa accelerazione e senza freno.
- Al termine della centrifugazione, rimuovere il plasma e cellule mononucleari (strato superiore) utilizzando una pipetta sterile di aspirazione in plastica.
- Trasferire lo strato inferiore (PMNs) in una nuova provetta conica sterile 50 mL.
- Aggiungere un volume equivalente di 0,45% NaCl di PMNs (mix bene e delicatamente ruotando il tubo).
- Centrifugare per 10 min 400 x g e a 25 ° C.
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Lisi delle cellule rosse
- Aggiungere 10 mL di acqua ghiacciata, sterile a pellettato cellule per 45 s seguita da 10 mL di gelida sterile 1,8% NaCl per ripristinare osmolalità.
Nota: Tutti i passaggi seguenti per isolamento di PMN devono essere eseguiti sul ghiaccio per evitare l'attivazione di PMN e rilascio prematuro di MP. Il passo di lisi stessa provoca l'attivazione di PMN minore ma non significativo, tuttavia, è essenziale per l'isolamento di una popolazione di PMN pura per analisi funzionali. - Centrifugare le cellule per 10 min a 250 x g a 4 ° C con decelerazione morbida.
- Ripeti punti 3.2.1 e 3.2.2.
- Risospendere PMNs in 5 mL di HBSS ghiacciata senza calcio o magnesio. Conteggio totale di cellule vive (USA un emocitometro e attuabilità macchiatura alla diluizione 1:2, Vedi Tabella materiali) prima di stimolazione.
Nota: PMNs isolato dovrebbe essere usato per la stimolazione o altri esperimenti entro 2 h di isolamento per evitare cambiamenti funzionali e cellulari e morte cellulare.
- Aggiungere 10 mL di acqua ghiacciata, sterile a pellettato cellule per 45 s seguita da 10 mL di gelida sterile 1,8% NaCl per ripristinare osmolalità.
4. MP isolamento da surnatanti attivato PMN
Nota: Un simile protocollo viene utilizzato per l'isolamento di MPs da PMNs murine ed umane.
- PMNs pellet (300 x g, 5 min, 4 ° C) e risospendere in 0,1 µm filtrata soluzione HBSS, contenente l'agente stimolante della scelta (per esempio 1 µM fMLF, vedere Nota: 2.3.1). Per stimolazione ottima utilizzare 100 µ l di soluzione di stimolazione per 10 milioni PMNs per 20-30 min a 37 ° C in provette da 15 mL.
- Dopo stimolazione, spin giù PMNs attivato a 600 x g per 5 min a 4 ° C e trasferire senza cellula surnatanti in nuove provette microcentrifuga da 1,5 mL.
- Centrifugare il supernatante PMN-cancellata a 13.000 x g, 10 min, 4 ° C per rimuovere i detriti cellulari e trasferire il surnatante eliminato in una nuova provetta di ultracentrifuga.
- Centrifugare per 1 h a 100.000 x g, a 4 ° C. Rimuovere i surnatanti prima dello stoccaggio MP. Se necessario, archivio pellettato MPs in paraffina sigillato tubi ultracentrifuga a-80 ° C fino all'utilizzo negli esperimenti.
5. esame dei PMN-MPs mediante Western Blotting
- Aggiungere 1% SDS tampone (50-200 µ l con 100 millimetri Tris pH: 7,4) a MPs a pellet (dal punto 4.4), trasferimento a nuovo per microcentrifuga da 1,5 mL e portare a ebollizione il lisato MPs per 5 min.
Nota: Il numero di parlamentari e il volume di tampone di Lisi deve essere regolato e ottimizzato per ogni proteina di interesse. -
Caricare gli importi uguali di PMN-MPs per corsia in tampone contenente β-mercapto-etanolo al 10% di carico.
Nota: Con il nostro metodo carichiamo i parlamentari che sono stati isolati dallo stesso numero di PMN stimolato.- Separare i lisati mediante SDS-PAGE su gel di poliacrilammide del 10% (utilizzare 50-100 V per 1-1,5 h) e il trasferimento di proteine totali sulle membrane di nitrocellulosa come descritto9.
- Membrane per 1 h con 5% senza grassi del latte in 0.05% Tween-20 soluzione fisiologica tamponata di bloccare e viene quindi incubato con un appropriato primario (una notte a 4 ° C), seguito da anticorpi secondari coniugati a HRP.
- Visualizzare le bande aggiungendo soluzione di chemiluminescenza per la membrana e l'esposizione ad una pellicola di raggi x all'interno di una cassetta a prova di luce (1-24 h).
6. l'esame dei PMN-MPs tramite flusso Cytometry
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Per la macchiatura dell'anticorpo, diluire gli anticorpi in modo appropriato nel buffer di FACS (PBS con 0,1 mM EDTA, 0,1% di sodio azide). Risospendere pellettato PMN-MPs (derivato da 1-3 x 106 PMNs/condizione) in 100 µ l di soluzione di anticorpo.
- Se la macchiatura per annessina V, risospendere pellettato PMN-MPs in tampone di Annexin V contenente 5 µ l di coniugato FITC Annessina V. Se co-macchiando con gli anticorpi, aggiungere gli anticorpi desiderati (per vedere un esempio Tabella materiali) direttamente alla soluzione di annessina V. Aggiungere il colorante fluorescente del lipido, N-(2-aminoethyl) maleimide (Vedi Tabella materiali), a 1 concentrazione µM in 100 µ l di tampone di FACS per etichettare e identificare MPs.
- Incubare la MPs nella macchiatura soluzione per almeno 20 min a 4 ° C.
- Lavare il MPs dall'ultracentrifugazione (1h a 100.000 x g, a 4 ° C); scartare il surnatante.
- Risospendere in FACS tampone ed eseguire gli esempi su un citometro a flusso designato dotato di un'unità elettronica aggiornata per una maggiore sensibilità (Vedi Tabella materiali).
7. le domande di isolato PMN-MPs studiare la funzione PMN nella guarigione delle ferite
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Somministrazione in vivo di PMN-MPs a coliche ferite
- Anestetizzare topi tramite un'iniezione intraperitoneale di una miscela di ketamina (100 mg/kg) e xilazina (5 mg/kg). Confermare l'anestesia da pedale reflex (pizzico di punta costante) e regolare secondo necessità.
- Posizionare il mouse sul suo stomaco e utilizzando pinze da biopsia di 28 cm e un endoscopio dotato di una fotocamera ad alta risoluzione (ad esempio un endoscopio veterinario per piccoli animali utilizzare, Vedi Tabella materiali), generare 3-5 ferite superficiali lungo il lato dorsale della due punti. Al termine del ferimento, topi di ritorno per una gabbia inserito su una stuoia di temperatura (37 ° C) fino a quando non ha recuperato.
- Anestetizzare topi (come al punto 7.1.1). Utilizzare un endoscopio per acquisire immagini di ferite inflitte post-ferendone 24 h (giorno 1). Lasciate che i topi recuperare come descritto al punto 7.1.2.
- Allo stesso tempo (24 h post-ferimento), amministrare murino PMN-MPs derivato da 2 x 106 PMNs in 100 µ l di HBSS + direttamente in ogni luogo della ferita usando un microinjection basati sulla colonscopia (uso un ago 29 G)9. Tre giorni più tardi (4 ° giorno post-ferimento) anesthetize topi (come al punto 7.1.1) e utilizza un endoscopio per riacquisire immagini di guarigione delle ferite. Lasciate che i topi recuperare come descritto al punto 7.1.2.
- Utilizzando software di analisi di immagine preferita (Vedi Tabella materiali), aree della struttura visibile ferita in immagini acquisite, misura l'area della stessa ferita ai giorni 1 e 4 post-ferendo e calcolare la percentuale di chiusura della ferita.
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Cellule umane epiteliali delle cellule in vitro guarigione della ferita
- BBe Caco-2 count o T84, cellule epiteliali intestinali umane di emocitometro e seme 5x105 cellule/pozzetto in piastre a 24 pozzetti coltura. Incubare le cellule in una camera standard di incubazione a 37 ° C e 5% CO2. Caco-2 BBe o T84 raggiungere confluency all'interno di 48 h9. Di cultura di cellule epiteliali, utilizzare DMEM e DMEM-F12 (50: 50) con i supplementi come precedentemente descritto9.
- Generare meccanica ai graffi ferite nello strato monomolecolare del utilizzando un puntale e bassa aspirazione come precedentemente descritto4,9. Acquisire immagini della ferita aree immediatamente dopo graffiare utilizzando un microscopio a contrasto di fase invertita interferenza differenziale (uso 5x o 10x obiettivi), per essere utilizzato come un tempo = punto di riferimento 0.
- MPs (derivato da 2-4 X 106 PMNs) in strati monomolecolari della cellula epiteliale graffiato-ferito ed incubare per altre 24 h (48 h post-ferimento, a 37 ° C con 5% CO2). In questo momento ri-acquisire immagini delle ferite-zero.
- Utilizzare software di analisi di immagine preferita (vedere Tabella materiali) per misurare aree ferita a t = 0 e t = 48 h. calcola la percentuale di chiusura della ferita determinando la differenza nella zona della ferita presso i punti di tempo selezionato.
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Representative Results
Analisi di cytometric di flusso rappresentativi dei parlamentari che sono stati isolati dall'essere umano e del mouse PMNs sono mostrati nella Figura 1. L'eterogeneità di dimensioni di PMN-MPs può essere valutato in confronto ai branelli di dimensioni conosciute come mostrato in Figura 1A, B per umano MPs. nota, sono state osservate differenze significative nella eterogeneità di dimensioni tra mouse e MPs umano. Allo stesso modo, mediante citometria a flusso e l'etichettatura di fluorescenza, espressione di proteina/s di scelta da MPs isolato di mouse o di origine umana può essere determinato. Ad esempio, può essere esaminata espressione di fosfatidil serina (PhS) macchiando di annessina V. Midollo osseo murino PMN-MPs sono mostrati in Figura 1C, D. Espressione di parecchi indicatori di scelta può essere valutato anche come illustrato per annessina V e CD11b macchiatura di MPs umano, Figura 2A, B. Un altro metodo per rilevare PMN-MPs da citometria a flusso è a macchia appena isolato PMNs prima stimolazione come mostrato nella Figura 2C. Ad esempio, PMN macchiatura con il marcatore di lipidi N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC prima fMLF risultati di stimolazione nel rilascio di MPs verde, che può essere facilmente individuata dal flusso. Di nota, mentre la colorazione con N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC è stato precedentemente utilizzato per etichettare e rilevare MPs che sono stati ottenuti da sangue periferico umano10 o iniettato in animali11, l'utilizzo di altri marcatori per fini di etichettatura applicazione in vitro o in vivo dovrebbe essere determinato da ciascun ricercatore. Oltre al flusso cytometry, PMN-MPs può essere analizzato mediante immunoblotting per le proteine di interesse. Come illustrato nella Figura 3, MPs derivato da PMNs umano che sono state stimolate con diversi noti attivatori, sono stati esaminati per l'espressione della chiave infiammatorie (matrice metallopeptidase 9 (MMP-9) e mieloperossidasi (MPO)) e molecole antinfiammatorie (Annessina A1). Come è evidente dal rappresentante immunoblots, stimolazione PMN con IFNγ (50 ng/mL), PMA (200 nM), e fMLF (1 µM) ha provocato la MPs che esprimono diversi livelli di MMP-9. Tuttavia, solo perturbazione del citoscheletro da prima Latrunculina B (1 µM) stimolazione con fMLF (5 µM) ha condotto all'abbondante presenza di MPO in PMN-MPs. Allo stesso modo, diversi livelli di Annexin A1 (alta a nessun rilevamento) sono stati rilevati su MPs condizioni attivante descritte di seguito. Questi risultati indicano che la composizione di PMN-MP è stimolo-dipendente.
Infine, illustrato nella figura 4 come isolato PMN-MPs possono essere utilizzate per studiare ferita curativa in vitro e in vivo nella lesione colica. PMN-MPs può essere aggiunto ai monostrati epiteliali zero-ferito in culture, dove la guarigione può essere controllata da imaging acquisition presso punti di tempo predeterminato. M/s può essere ulteriormente microiniettati direttamente nelle ferite coliche, che sono state generate da pinze per biopsia e imaging endoscopico9, e loro effetto sulla guarigione può essere valutato. Per l'analisi in vitro ed in vivo di guarigione della ferita, immagini di ferite inflitte sono acquisiti immediatamente post ferentesi (o altrimenti specificato) e continuamente attraverso il processo di guarigione a intervalli di tempo predeterminati. Utilizzando software di analisi di immagine disponibili in commercio, cambiamenti nella zona della ferita (dimensione) sono misurati e utilizzati per determinare il tasso di chiusura della ferita. Applicazione di PMN-MPs che contengono MPO peruno monostrati epiteliali in coltura o in vivo alle ferite coliche ha effetti nocivi, che porta a guarigione ritardata9.
Figura 1 . Analisi della dimensione di PMN-MP e gli indicatori di superficie tramite flusso cytometry. (A) citometro a flusso ottimizzato microsfere di controllo (Vedi Tabella materiali) di dimensioni note e valori di dispersione sono mostrati nella rappresentazione ortogonale SSC e FSC. Le perle vengono utilizzate per ottenere un confronto di dimensioni relative con un campione di PMN-MP mostrato in B. (B) umano PMN-MPs sono stati isolati e analizzati tramite flusso cytometry utilizzando condizioni descritte per le perline. L'eterogeneità nei formati MP può essere visto. (C–D) MPs derivate dal midollo osseo murino fMLF-stimolata che PMNs sono stati analizzati tramite flusso cytometry. Diagrammi di flusso di rappresentante mostrare non macchiate (C) o Annexin V-FITC macchiato (D) m/s. area rettangolare spettacoli MPs Annessina V-positive (FITC-positivi MPs). SSC: Side Scatter; FSC: Forward Scatter; PhS: Fosfatidil serina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Macchiatura di PMN-MP e analisi tramite flusso cytometry. Immacolata (A) e (B) Annexin V-FITC e hCD11b-APC-tinto MPs. Square area racchiude una Annexin V/CD11b doppia popolazione positiva di PMN-MPs. (C) appena isolato umano PMNs (1 x 106) sono stati macchiati con un colorante fluorescente , N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC e stimolate con fMLF. M/s sono stati isolati da surnatanti delle cellule e analizzati tramite flusso cytometry. Area rettangolare racchiude una popolazione MP positiva di N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC (M-FITC, etichetta asse y). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . Composizione di PMN-MPs è stimolo-dipendenti. (A) umano PMNs sono stati stimolati con IFNγ, TNFα, fMLF, PMA o una combinazione di latranculin B seguita da fMLF (LtB-fMLF). M/s sono stati isolati da surnatanti delle cellule risultanti dall'ultracentrifugazione e lisati di proteina sono stati preparati in tampone SDS 1%. Proteine sono state separate da dimensione elettroforeticamente in un gel di poliacrilammide del 10%, trasferite ad una membrana di nitrocellulosa e sondate per il MMP-9, MPO oppure A1 Annexin anticorpo primario seguita dagli anticorpi secondari HRP-coniugato appropriati. (B) rappresentante la microscopia immagini di PMN umano-MPs raffigurano dimensioni eterogeneità. Un esosomi < 100 nm in dimensione è indicata dalla freccia bianca. Barra della scala = 250 nm (pannello a destra e sinistro). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: L'uso di isolato PMN-MPs nello studio del ruolo di PMNs in epiteliali guarigione della ferita. BBe di Caco-2 (A) cellule epiteliali intestinali umane erano cromate a confluenza, zero-feriti e sottoposti a MPs derivato da PMNs 3 milioni, che sono stati aggiunti immediatamente post-ferimento. Immagini rappresentative mostrano la chiusura della ferita (48 h post-ferimento) nel controllo (pannelli a sinistra) e cellule epiteliali PMN-MP-trattati (pannelli di destra). Barra della scala = 100 µm. (B) per esaminare l'effetto di PMN-MPs su colica ferita curativa in vivo, isolato PMN-MPs sono stati iniettati direttamente nell'area della ferita usando un sistema basato su endoscopia microiniezione (alle 24h post-ferimento, la ferita colica è delineato da una linea tratteggiata e l'iniezione di iniezione è indicato da una freccia bianca). La chiusura della ferita è stati valutati 3 giorni più tardi (4 giorni post-ferimento) da formazione immagine endoscopica. Barra della scala = 300 µm. (C) 4 giorni post-ferendo topi sono stati eutanasizzati e ferite della mucosa coliche sono state estratte con le forbici, incorporate in composto di taglio ottimale temperatura (O.C.T) e congelate con azoto liquido. Micrometro di otto sezioni delle ferite sono state macchiate per E-cadherin (verde) e la macchia nucleare DAPI (blu) valutare il livello di riepitelizzazione (pannelli superiori) o per DAPI (blu) e Ki67 (rosso) di visualizzare le cellule epiteliali proliferanti e totale al il bordo della ferita (pannelli inferiori). Barra della scala = 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Protocolli per l'isolamento e la caratterizzazione di PMN-derivato MPs sono descritti nella presente comunicazione. Parecchi punti critici chiave deve tener conto per il successo della procedura. In primo luogo, PMNs deve essere isolato fresco e usato negli esperimenti entro 2 h di isolamento per prevenire degranulazione e attivazione spontanea. Tutte le gestione di PMNs durante l'isolamento e fino al punto di stimolazione deve essere eseguita sul ghiaccio per impedire l'attivazione e prematuro MP versione12. In secondo luogo, ultracentrifugazione per 1 h o più massimizza la cubettatura di MPs. in terzo luogo, per l'analisi di citometria a flusso, lo strumento deve essere calibrato correttamente con un mix di perline fluorescenti specificato dello strumento (il tipo di perline è regolato ad un particolare strumento) per definire correttamente formati MP. Ad esempio, mentre un produttore di citometri a flusso consiglia di utilizzare perline FSC come parametro correlate alle dimensioni, gli altri sono stati ottimizzati per perline SSC. Inoltre, il citometro a flusso da utilizzare per l'analisi di MP deve essere dotato di elettronica aggiornata per risolvere meglio MPs dal rumore di fondo.
Per identificare correttamente MPs oltre ai parametri di dimensione, si consiglia vivamente l'uso di fluorescenza di colorazione come descritto nelle procedure di cui sopra. Inoltre, tutte le soluzioni durante la preparazione e l'isolamento devono essere filtrate attraverso un sistema di filtro 0,1 µm per ridurre al minimo l'inclusione di particelle di polvere o altri precipitati che aumenteranno il rumore di fondo durante l'acquisizione tramite flusso cytometry. Cosa importante, le condizioni di conservazione di MPs dovrebbero essere considerate. Piccola prova8e nostre osservazioni non pubblicate, suggeriscono che MP congelamento conduce alla rottura della membrana e la rottura di MP. Infine, diverse condizioni di attivazione di PMN e la tempistica può cambiare e migliora il rendimento del MP.
Ci sono alcune limitazioni a questo metodo. Isolamento del mouse PMNs dal midollo osseo non è in genere puro (~ 85 – 90%) ed è contaminato da altre cellule immuni (principalmente linfociti mononucleari) come è stata determinata dall'analisi cytometric di flusso. Pertanto, gli isolati risultanti possono includere piccole quantità di MPs rilasciato da altre cellule immuni. Alternative sono disponibili e comprendono isolamento di PMNs dai branelli magnetici commercialmente disponibili, tuttavia, questo sarebbe un più lungo e una procedura significativamente più costoso. Infine, senza fluorescenza di etichettatura, oltre ai parametri di dimensione, differenziazione definitiva di MPs da polvere o altre particelle solubili o dispersa nell'aria di dimensioni simili che possono contaminare il campione sono impegnativo ed error-prone.
In futuro, l'ordinamento di PMN-MPs etichettati con marcatori specifici aiuterà delucidare composizione MP sotto specifiche condizioni stimolatore o modelli di malattia e speriamo che consentono l'uso di MPs come marcatori diagnostici e potenziali bersagli terapeutici per il trattamento malattie infiammatorie.
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Disclosures
Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi di qualsiasi natura in relazione alla presente comunicazione
Acknowledgments
Siamo grati per l'assistenza tecnica del Dr. Suchitra Swaminathan che gestisce il nucleo di Northwestern Feinberg School di medicina citometria a flusso. Finanziamento è stato fornito da DK101675 (NIH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning | 10-041-CV | |
| Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) | Atlanta Biologics | S11150 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) | GIBCO | 15140 | |
| 0.5 M EDTA | Fisher | BP2482 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9888 | Sterile and filtered through a 0.1 micron filter unit |
| Sterile filtered Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | |
| Sterile filtered Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Density 1.119 g/ml. Solution of polysucrose and sodium diatrizoate. Bring to room temperature |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium | Cellgro | 210-40-CV | |
| Ethyl Alcohol (200 proof) | Decon labs | 2701 | |
| HBBS | Corning | 21-022-CV | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Sigma | T8154 SIGMA | Diluted 1:2 for cell viability counting |
| Isoflurane | Abbot | 50033 | |
| Anti-human CD11b-APC conjugated | Biolegend | 301350 | Clone ICRD44 (Final concetration: 1 µg/mL) |
| BODIPY FL | Invitrogen | B10250 | N-(2-aminoethyl) maleimide |
| Annexin V Binding Buffer | Biolegend | 422201 | |
| Calibration Beads for Flow Cytometry | BioCytex | 7803 | |
| FITC Annexin V | Biolegend | 640906 | |
| Polymorphprep | Axis-Shield PoC AS | Sodium diatrizoate/Dextran 500, density 1.113 g/ml | |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | ||
| 15 ml centrifuge tubes | Corning | 430053 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 25 ml serological pipettes | Celltreat | 229225B | |
| 10 ml serological pipettes | Celltreat | 229210B | |
| 5 ml serological pipettes | Celltreat | 229205B | |
| Pasteur pipettes | BD Falcon | 357575 | |
| 25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) | BD | 305122 | |
| 100 µm cell strainers | Celltreat | 229485 | |
| Vacutainer tubes | BD | 367251 | |
| Equipment | |||
| LSR Fortessa Special Order Research Product (SORP) | BD | (SORP) | |
| Swinging bucket centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75007210 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | (L8-80 M) | |
| Micro-centrifuge | ThermoFisher Scientific | VV-17703-15 (Fresco 17) | |
| Swinging bucket centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004503 (Megafuge 40R) | |
| Biopsy forceps, 28 cm | Storz | 27071zj | |
| Software | |||
| Image J | National Institute of Health | Open source |
References
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