Cell Membrane Repair Assay met behulp van een Laser van het twee-foton microscoop

Summary

Cell membrane verwonding via twee-foton laser is een veelgebruikte methode voor de beoordeling van de membraan opnieuw verzegelen vermogen en kan worden toegepast op meerdere celtypes. Hier beschrijven we een protocol voor in vitro live-imaging membraan daarvan in dysferlinopathy patiënten cellen na twee-foton laser van het baarmoederslijmvlies.

Abstract

Talrijke pathofysiologische beledigingen kunnen schade toebrengen aan celmembranen en wanneer in combinatie met aangeboren gebreken in de celmembraan reparatie of integriteit, kunnen leiden tot ziekte. Inzicht in de moleculaire mechanismen rond celmembraan reparatie is daarom een belangrijke doelstelling voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën voor ziekten in verband met disfunctionele celmembraan dynamiek. Twee-foton laser ablatie veel in vitro en in vivo studies gericht op het begrijpen van de celmembraan opnieuw verzegelen in verschillende contexten van de ziekte gebruiken als maatstaf voor het bepalen van de functionele uitkomsten na experimentele behandelingen. In deze test, zijn celmembranen onderworpen aan verwonding met een twee-foton laser, waardoor de celmembraan breuk en fluorescente kleurstof te infiltreren in de cel. De intensiteit van de fluorescentie binnen de cel kan vervolgens worden gecontroleerd om te kwantificeren van de cel kunnen verzegelen zelf. Er zijn verschillende alternatieve methoden voor de beoordeling van de celmembraan reactie op schade, evenals de grote variatie in de twee-foton laser verwonden aanpak zelf, dus een enkele, uniforme model van cel verwonden beneficiair te verminderen zou dienen de het verschil tussen deze methoden. In dit artikel schetsen wij een eenvoudige twee-foton laser protocol voor de beoordeling van de celmembraan reparatie in vitro in beide gezond en dysferlinopathy patiënt fibroblast cellen transfected met of zonder een full-length dysferlin plasmide verwonden.

Introduction

Het celmembraan van eukaryotische cellen bestaat uit een dubbele laag van eiwit-studded fosfolipiden die definieert het intra/extracellulaire milieu van de cel en is essentieel voor het behoud van cellulaire homeostase en cel overleven. Celmembraan verwondingen als gevolg van mechanische of chemische beledigingen zijn gemeengoed in verschillende zoogdieren celtypen, met inbegrip van skelet en hartspier, maag en longen cellen^1,2,3,4. Naast Blessures gevolg van dagelijkse fysiologische functie, kunnen celmembranen ook worden beschadigd door milieu beledigingen, bacteriële toxines en ischemische reperfusie⁵. Niet verzegelen van breuken in de celmembraan leidt tot een ongecontroleerde toestroom van extracellulaire Ca^{2 +}– samen met andere potentieel giftige componenten van de extracellulaire – in de cel, triggering stroomafwaarts signaal cascades die snel in cel resulteren kunnen dood^1,4,5,6.

Tot op heden, zijn er verschillende voorgestelde modellen voor membraan reparatie in cellen. Verschillende herstelmechanismes kunnen worden geactiveerd afhankelijk van de grootte en de aard van de breuk van het membraan. Bijvoorbeeld, wordt voorgesteld dat celmembranen gebruik maken van kan laterale stroom of eiwit verstopping om te herstellen van kleine verstoringen (< 1 nm). De laterale fusion-model stelt dat membraan breuken zijn snel mended via laterale aanwerving van dysferlin-bevattende membraan⁷, terwijl het eiwit verstopping model suggereert dat kleine perforaties via eiwit aggregaties zijn mended (meestal annexins) ⁸. omgekeerd, grotere membraan laesies leiden tot Ca^{2 +}-afhankelijk, dysferlin-gemedieerde vesikel kernversmelting en de vorming van een reparatie patch. In de reparatie patch model, een snelle Ca^{2 +} toestroom in de cel activeert de aanwerving van meerdere eiwitten (dysferlin, annexins, mitsugumin-53 en EDH eiwitten) die een complex of “patch”, samen met een fusie van intracellulaire vesikels vormen of Lysosomen op de site van membraan beschadigen^4,9,10,11,12. Het is belangrijk op te merken dat deze modellen elkaar niet noodzakelijkerwijs uitsluiten en in concert werken kunnen om reparatie van de membraan. Niet goed verzegelen celmembraan schade is gekoppeld aan meerdere ziekte staten, met inbegrip van spierdystrofie (dysferlinopathy – met inbegrip van Miyoshi myopathie, limb-girdle spierdystrofie type IIB en distale myopathie met anterior tibiale begin) ¹³, cardiomyopathie¹⁴, en Chediak-Higashi syndroom (CHS)¹⁵.

Gezien de juiste cel membraan integriteit en opnieuw verzegelen speelt zo’n belangrijke rol in gezondheid en ziekte, een dieper begrip van de moleculaire mechanismen van celmembraan reparatie gunstig zou zijn in de zoektocht naar nieuwe therapeutische strategieën. Het is daarom noodzakelijk te beschikken over passende experimentele technieken om te controleren de kinetiek en evalueren van het vermogen van de celmembraan reparatie. Verscheidene in vitro methoden voor de modellering van de reparatie van de membraan zijn ontworpen. Een strategie gaat om mechanische schade, die kan worden vergemakkelijkt door de cel schrapen met een pipet/chirurgisch mes/scheermes of door glaskralen kantelen de cellen¹⁶. Echter dit soort mechanische schade grotere laesies genereert en creëert een hoge mate van variatie in cel letsel, zowel binnen als tussen culturen.

Een andere methode voor de opwekking van membraan wonden is laser ablatie door twee-foton microscopie. In tegenstelling tot traditionele laser confocal microscopie die gebruikmaakt van één foton excitatie, gebruikt de laser twee-foton gelijktijdig twee lange golflengte, lage-energie fotonen ter vergemakkelijking van de excitatie van een hoog-energetische elektronen¹⁷. Dit niet-lineaire proces resulteert in excitatie uitsluitend binnen het brandvlak en niet langs de gehele lichtpad¹⁷ (Figuur 1). Dit verminderde excitatie volume helpt bij het minimaliseren van photodamage wanneer imaging levende cellen^18,19. Daarom zijn onderzoekers kunnen produceren nauwkeurige laesies in de celmembraan en monitor membraan opnieuw verzegelen in real-time met behulp van fluorescente kleurstoffen en observeren van wijzigingen in de intensiteit van de fluorescentie als de celmembraan breuken en vervolgens verzegelingen.

Deze aanpak is herhaaldelijk gebruikt om studeren membraan verwonding in vitro en in vivo en in meerdere cel typen^20,21. Bijvoorbeeld membraan herstellen gebreken in fibroblasten en myotubes afgeleid van dysferlinopathy patiënten werden beoordeeld met behulp van deze techniek^22,23. Ook werden enkele spiervezels geïsoleerd van muizen gebruikt om de reparatie patch vorming^13,24,25te controleren. De beweging van fluorescently tagged eiwitten kan ook worden waargenomen tijdens membraan reparatie in enkele spiervezels⁹. Bovendien, het proces van sarcolemmal reparatie na twee-foton laser verwonding in zebrafish embryo’s kan worden waargenomen in real-time in vivo²⁶.

In dit artikel duidelijk naar voren komt een methodologie voor de beoordeling van de dynamiek van de reparatie van de celmembraan in fibroblasten met behulp van twee-foton laser verwonden, hoewel deze methode kan worden toegepast op verschillende celtypen, met het oog op het kwantificeren van plasmamembraan opnieuw verzegelen van vermogen in vitro. Bij deze methode worden de cellen geïncubeerd met FM4-64, een lipofiele, cel-ondoordringbare kleurstof die snel licht als het bindt aan negatief geladen fosfolipiden in het cytoplasma bij binnenkomst in de cel door de membraan-laesie (Figuur 2& 3). kwantificering van kleurstof fluorescentie grenzend aan de laesie membraan zorgt voor controle van de tijd die nodig is voor de celmembraan te verzegelen zelf. Om te illustreren het nut van deze methode, gebruiken we dysferlinopathy patiënt fibroblasten transfected met plasmiden GFP-geconjugeerde full-length dysferlin (DYSF) te beoordelen van de redding van de celmembraan reparatie.

Protocol

Menselijke fibroblast cellen die worden gebruikt in deze studie werden gebruikt met goedkeuring van de menselijke ethische commissie van de faculteit geneeskunde en tandheelkunde bij de Universiteit van Alberta. 1. de transfectie van cellen met full-length DYSF plasmide Cultuur fibroblast cellen in een T225 kolf met 40 mL groei media – 36 mL Dulbecco van bewerkt Eagle Medium (DMEM), 4 mL van foetale runderserum (FBS) en 20 µL van penicilline/streptomycine (P/S) – in een CO2</…

Representative Results

Gezonde menselijke fibroblasten, dysferlinopathy niet-behandelde patiënten fibroblasten en patiënt fibroblasten transfected met een plasmide met de full-length dysferlin volgorde werden onderworpen aan twee-foton laser verwonden om te beoordelen membraan opnieuw verzegelen van vermogen in real-time. Gezonde menselijke fibroblast cellen weergegeven lage niveaus van FM 4-64 fluorescentie activering na laser verwonden en niet-behandelde patiënten fibroblasten tentoongesteld een hoge mate …

Discussion

Twee-foton laser verwonden van de celmembraan is een nauwkeurige en veelzijdige techniek voor de beoordeling van de dynamiek van membraan opnieuw verzegelen in vitro. In dit artikel beschreven we een protocol voor het bepalen van de celmembraan opnieuw verzegelen vermogen in dysferlinopathy patiënten cellen met behulp van de laser van de twee-foton assay verwonden. Onze resultaten tonen aan dat dysferlinopathy patiënt cellen met gebreken in het celmembraan opnieuw verzegelen zijn, die strookt met de bevindinge…

Materials

Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher	11320033
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F1051
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher	15140122
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher	25300062
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537
35mm collagen-coated glass-bottom dishes	MatTek	P53GCOL-1.5-14-C
Serum-deprived media	Thermo Fisher	31985070
Transfection reagent	Thermo Fisher	15338100
FM 4-64 Dye	Invitrogen	T13320
Tyrode’s Salts Solution	Sigma-Aldrich	T2397
Confocal laser scanning microscope	Carl Zeiss	NA
Chameleon Two-photon laser	Coherent	NA