Analisi di riparazione della membrana cellulare usando un microscopio a due fotoni Laser
Summary
Membrana cellulare ferendo tramite due fotoni laser è un metodo ampiamente usato per la valutazione della membrana risigillazione capacità e può essere applicato a più tipi di cellule. Qui, descriviamo un protocollo in vitro live-imaging per membrana menzionerà in disferlinopatia paziente cellule dopo ablazione laser del due-fotone.
Abstract
Numerosi insulti patofisiologici possono danneggiare le membrane cellulari e, quando accoppiato con difetti innati nella riparazione della membrana cellulare o integrità, possono provocare la malattia. Comprensione dei meccanismi molecolari sottostanti che circonda la riparazione della membrana delle cellule è, pertanto, un obiettivo importante per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche per malattie connesse con dinamiche disfunzionali della membrana cellulare. Molti studi in vitro ed in vivo , finalizzati alla comprensione di chiusura in vari contesti di malattia della membrana cellulare utilizzano l’ablazione laser del due-fotone come standard per la determinazione dei risultati funzionali dopo trattamenti sperimentali. In questa analisi, le membrane cellulari sono sottoposte a ferimento con un laser del due-fotone, che provoca la membrana cellulare per rottura e tintura fluorescente per infiltrarsi nella cella. L’intensità di fluorescenza all’interno della cellula può essere monitorata quindi per quantificare la capacità della cellula di risigillare stessa. Ci sono diversi metodi alternativi per la valutazione della risposta della membrana cellulare a lesioni, come pure la grande variazione nel due-fotone laser ferendo approccio stesso, pertanto, un modello unificato di cella ferendo beneficamente servirebbe a diminuire il variazione tra queste metodologie. In questo articolo, descriviamo un semplice due fotoni laser ferendo il protocollo per la valutazione della membrana cellulare riparazione in vitro in entrambi sani e disferlinopatia paziente del fibroblasto cellule trasfettate con o senza un plasmide dysferlin full-length.
Introduction
La membrana cellulare delle cellule eucariotiche è costituito da un doppio strato di fosfolipidi tempestato di proteina che definisce l’ambiente intra/extracellulari della cella ed è essenziale per il mantenimento della sopravvivenza delle cellule e l’omeostasi cellulare. Membrana cellulare lesioni derivanti da insulti meccanici o chimici sono comuni in vari tipi di cellule di mammiferi, tra cui scheletrico e muscolo cardiaco, stomaco e polmone cellule1,2,3,4. Oltre alle lesioni conseguenti alla funzione fisiologica quotidiana, le membrane cellulari può essere danneggiate anche da insulti ambientali, tossine batteriche e riperfusione ischemica5. Errore per sigillare le rotture nella membrana cellulare comporta un afflusso non regolamentato di extracellulare Ca2 +– insieme ad altri componenti extracellulari potenzialmente tossici – nella cellula, innescando cascate di segnale a valle che possono rapidamente portare in cella 5,1,4,di morte6.
Fin qui, ci sono stati diversi modelli proposti per la riparazione di membrana in cellule. Meccanismi di riparazione diversi possono essere attivati a seconda della dimensione e natura della rottura della membrana. Ad esempio, è suggerito che le membrane cellulari può utilizzare flusso laterale o proteina intasamento per riparare piccoli guasti (< 1 nm). Il modello di fusione laterale propone che rotture della membrana sono rapidamente riparate attraverso reclutamento laterale di dysferlin-contenente membrana7, mentre la proteina intasamento modello suggerisce che piccole perforazioni sono riparate attraverso aggregazioni di proteina (principalmente annexins) 8. al contrario, le più grandi lesioni della membrana innescano Ca2 +-fusione della vescicola dipendente, dysferlin-mediata e la formazione di una patch di riparazione. Nel modello di patch di riparazione, un rapido afflusso Ca2 + nella cella attiva il reclutamento di proteine multiple (disferlina, annexins, mitsugumin-53 e proteine EDH) che formano un complesso o “patch”, insieme a una fusione delle vescicole intracellulari o i lisosomi presso il sito della membrana danneggiano4,9,10,11,12. È importante notare che questi modelli non sono necessariamente mutuamente esclusivi e possono lavorare di concerto per facilitare la riparazione della membrana. Fallimento per sigillare correttamente danno della membrana delle cellule è associato a più Stati di malattia, compreso la distrofia muscolare (disferlinopatia – tra cui Miyoshi myopathy e distrofia muscolare dei cingoli, tipo IIB e miopatia distale con esordio tibia anteriore) 13, cardiomiopatia14e Chediak-Higashi sindrome (CHS)15.
Data tale integrità della membrana cellulare corretta e risigillazione gioca un ruolo importante nella salute e nella malattia, una più profonda comprensione dei meccanismi molecolari sottostanti di riparazione della membrana cellulare sarebbe utile nella ricerca di nuove strategie terapeutiche. È, pertanto, necessario possedere adeguate tecniche sperimentali per la cinetica di monitorare e valutare la capacità di riparazione della membrana cellulare. Sono stati progettati diversi metodi in vitro per la modellazione di riparazione della membrana. Una strategia comporta danno meccanico, che può essere facilitata da cella raschiando con un pipetta/chirurgica/rasoio della lama o dal ribaltamento le cellule16perle di vetro. Tuttavia, questo tipo di danno meccanico genera più grandi lesioni e crea un alto grado di variazione nella lesione delle cellule, sia all’interno che tra le culture.
Un altro metodo per generare le ferite della membrana è l’ablazione laser da microscopia del due-fotone. In contrasto con la microscopia confocale laser tradizionale che si avvale di eccitazione di singolo fotone, il laser del due-fotone utilizza contemporaneamente due fotoni di lunghezza d’onda, basso consumo energetico per facilitare l’eccitazione di un elettrone ad alta energia17. Questo processo non lineare provoca eccitazione esclusivamente all’interno del piano focale e non lungo l’ intero percorso della luce17 (Figura 1). Questo ridotto volume di eccitazione consente di minimizzare photodamage quando imaging cellule vive18,19. I ricercatori sono quindi in grado di generare lesioni precise nella membrana cellulare e monitor membrana una chiusura in tempo reale utilizzando coloranti fluorescenti e osservare i cambiamenti dell’intensità di fluorescenza come le rotture della membrana cellulare e quindi reseals.
Questo approccio è stato utilizzato ripetutamente per studiare membrana ferendo in vitro e in vivo e in cella più tipi di20,21. Ad esempio, membrana riparare difetti nei fibroblasti e miotubi derivato da disferlinopatia pazienti sono stati valutati usando questa tecnica22,23. Inoltre, singole fibre muscolari isolate da topi sono state utilizzate per monitorare la riparazione patch formazione13,24,25. Il movimento delle proteine fluorescente contrassegnati può essere osservato anche durante la riparazione della membrana in singole fibre muscolari9. Inoltre, il processo di riparazione sarcolemma seguendo due fotoni laser ferendo negli embrioni di zebrafish può essere osservato in tempo reale in vivo26.
In questo articolo, descriviamo una metodologia per la valutazione dinamica di riparazione della membrana cellulare in fibroblasti utilizzando due fotoni laser ferendo, anche se questa metodologia può essere applicata a vari tipi di cellule allo scopo di quantificare la membrana plasmatica chiusura della capacità in vitro. In questo metodo, le cellule vengono incubate con FM4-64, un colorante lipofilico, cella-impermeabile che reagisce rapidamente in quanto si lega al negativamente caricata fosfolipidi all’interno del citoplasma al momento di entrare nella cellula attraverso la lesione della membrana (Figura 2& 3). quantificazione della fluorescenza di tintura adiacente alla lesione della membrana permette di monitorare il tempo che occorre per la membrana cellulare sigillare stessa. Per esemplificare l’utilità di questo metodo, usiamo disferlinopatia transfettati con i plasmidi GFP-coniugato full-length dysferlin (DYSF) nei fibroblasti del paziente per valutare il salvataggio di riparazione della membrana cellulare.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ferendo due fotoni laser della membrana cellulare è una tecnica versatile e precisa per valutare le dinamiche della membrana una chiusura in vitro. In questo articolo, abbiamo descritto un protocollo per la determinazione della membrana cellulare chiusura della capacità in disferlinopatia paziente cellule utilizzando il laser del due-fotone ferendo dosaggio. I nostri risultati indicano che le cellule pazienti disferlinopatia sono difettose in chiusura della membrana cellulare, che è coerente con i risultati d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dalla University of Alberta facoltà di medicina e odontoiatria, The gli amici di Garrett Cumming ricerca sedia, HM Toupin neurologici scienza ricerca sedia fondo, distrofia muscolare Canada, Canada Fondazione per l’innovazione (CFI), Alberta educazione e tecnologia avanzata (AET), istituti canadesi di Health Research (CIHR), viaggio di Jesse – la Fondazione per Gene e terapia cellulare, donne e Health Research Institute bambini (WCHRI), e Alberta innova soluzioni di salute (AIHS ).
Vorremmo ringraziare il Dr. Steven Laval per la fornitura di noi con il plasmide dysferlin full-length. Vorremmo anche ringraziare il Dr. Katsuya Miyake per consulenza tecnica.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher | 25300062 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 35mm collagen-coated glass-bottom dishes | MatTek | P53GCOL-1.5-14-C | |
| Serum-deprived media | Thermo Fisher | 31985070 | |
| Transfection reagent | Thermo Fisher | 15338100 | |
| FM 4-64 Dye | Invitrogen | T13320 | |
| Tyrode’s Salts Solution | Sigma-Aldrich | T2397 | |
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | NA | |
| Chameleon Two-photon laser | Coherent | NA |
References
- Cong, X., Hubmayr, R. D., Li, C., Zhao, X. Plasma membrane wounding and repair in pulmonary diseases. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 312 (3), L371-L391 (2017).
- Demonbreun, A. R., McNally, E. M. Plasma Membrane Repair in Health and Disease. Curr Top Membr. 77, 67-96 (2016).
- McNeil, P. L., Ito, S. Gastrointestinal cell plasma membrane wounding and resealing in vivo. Gastroenterology. 96 (5 Pt 1), 1238-1248 (1989).
- McNeil, P. L., Kirchhausen, T. An emergency response team for membrane repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (6), 499-505 (2005).
- Cooper, S. T., McNeil, P. L. Membrane Repair: Mechanisms and Pathophysiology. Physiol Rev. 95 (4), 1205-1240 (2015).
- Geeraerts, M. D., Ronveaux-Dupal, M. F., Lemasters, J. J., Herman, B. Cytosolic free Ca2+ and proteolysis in lethal oxidative injury in endothelial cells. Am J Physiol. 261 (5 Pt 1), C889-C896 (1991).
- McDade, J. R., Archambeau, A., Michele, D. E. Rapid actin-cytoskeleton-dependent recruitment of plasma membrane-derived dysferlin at wounds is critical for muscle membrane repair. FASEB J. 28 (8), 3660-3670 (2014).
- Benninger, R. K., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4 (Unit 4), 11-24 (2013).
- Demonbreun, A. R., et al. An actin-dependent annexin complex mediates plasma membrane repair in muscle. J Cell Biol. 213 (6), 705-718 (2016).
- McNeil, P. L., Khakee, R. Disruptions of muscle fiber plasma membranes. Role in exercise-induced damage. Am J Pathol. 140 (5), 1097-1109 (1992).
- Rodriguez, A., Webster, P., Ortego, J., Andrews, N. W. Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells. J Cell Biol. 137 (1), 93-104 (1997).
- Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106 (2), 157-169 (2001).
- Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423 (6936), 168-172 (2003).
- Han, R., et al. Dysferlin-mediated membrane repair protects the heart from stress-induced left ventricular injury. J Clin Invest. 117 (7), 1805-1813 (2007).
- Huynh, C., Roth, D., Ward, D. M., Kaplan, J., Andrews, N. W. Defective lysosomal exocytosis and plasma membrane repair in Chediak-Higashi/beige cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (48), 16795-16800 (2004).
- Corrotte, M., Castro-Gomes, T., Koushik, A. B., Andrews, N. W. Approaches for plasma membrane wounding and assessment of lysosome-mediated repair responses. Methods Cell Biol. 126, 139-158 (2015).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Jontes, J. D., Buchanan, J., Smith, J. S. Growth cone and dendrite dynamics in zebrafish embryos: early events in synaptogenesis imaged in vivo. Nat Neurosci. 3 (3), 231-237 (2000).
- Galbraith, J. A., Terasaki, M. Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation. Mol Biol Cell. 14 (5), 1808-1817 (2003).
- McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. The endomembrane requirement for cell surface repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (8), 4592-4597 (2003).
- Weisleder, N., et al. Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems. J Vis Exp. (52), (2011).
- Matsuda, C., Kiyosue, K., Nishino, I., Goto, Y., Hayashi, Y. K. Dysferlinopathy Fibroblasts Are Defective in Plasma Membrane Repair. PLoS Curr. 7, (2015).
- Philippi, S., et al. Dysferlin-deficient immortalized human myoblasts and myotubes as a useful tool to study dysferlinopathy. PLoS Curr. 4, RRN1298 (2012).
- Cai, C., et al. MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery. Nat Cell Biol. 11 (1), 56-64 (2009).
- Swaggart, K. A., et al. Annexin A6 modifies muscular dystrophy by mediating sarcolemmal repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (16), 6004-6009 (2014).
- Roostalu, U., Strahle, U. In vivo imaging of molecular interactions at damaged sarcolemma. Dev Cell. 22 (3), 515-529 (2012).
- Azakir, B. A., et al. Modular dispensability of dysferlin C2 domains reveals rational design for mini-dysferlin molecules. J Biol Chem. 287 (33), 27629-27636 (2012).
- Lee, J., Yokota, T., Takeda, S., Miyagoe-Suzuki, Y., Mori-Yoshimura, M. Ch 6. Translational Research in Muscular Dystrophy. , 87-102 (2016).
- Barthelemy, F., Wein, N., Krahn, M., Levy, N., Bartoli, M. Translational research and therapeutic perspectives in dysferlinopathies. Mol Med. 17 (9-10), 875-882 (2011).
