Cellemembranen reparasjon analysen ved hjelp av to-fotonet Laser mikroskop
Summary
Cellemembranen såret via to-fotonet laser er en mye brukt metode for å vurdere membran resealing evne og kan brukes på flere celletyper. Her beskriver vi en protokoll for i vitro live bildebehandling av membran resealing i dysferlinopathy pasienten celler etter to-fotonet laser ablasjon.
Abstract
Mange patofysiologiske fornærmelser kan skade cellemembraner og når kombinert med medfødte mangler i cellemembranen reparasjon eller integritet, kan føre til sykdom. Forstå de underliggende molekylære mekanismene rundt cellemembranen reparasjon er derfor et viktig mål for utviklingen av romanen strategier for sykdommer forbundet med dysfunksjonelle cellemembranen dynamikk. Mange i vitro og i vivo studier rettet mot å forstå cellemembranen resealing i ulike sykdom sammenhenger benytte to-fotonet laser ablasjon som standard for å bestemme funksjonelle resultater etter eksperimentelle behandlinger. I denne analysen, er celle membraner utsatt for såret med en to-fotonet laser, som forårsaker cellemembranen brudd og fluorescerende farge å infiltrere cellen. Intensiteten av fluorescens i cellen kan deretter overvåkes for å kvantifisere cellenes evne til å forsegle selv. Det er flere alternative metoder for å vurdere celle membran svar på skader, samt stor variasjon i to-fotonet laser såret tilnærming selv, derfor en enkelt, enhetlig modell av cellen såret ville fordel tjene til å redusere den variasjon mellom disse metodene. I denne artikkelen skissere vi en enkel to-fotonet laser såret protokollen for å vurdere celle membran reparasjon i vitro i både sunn og dysferlinopathy pasienten fibroblast celler transfekterte med eller uten en full lengde dysferlin plasmider.
Introduction
Cellen membran av eukaryote celler består av en to-lags av protein-piggdekk fosfolipider som definerer intra/ekstracellulære miljøet i cellen og er avgjørende for å opprettholde mobilnettet homeostase og celle overlevelse. Cellemembranen skader som følge av mekanisk eller kjemikalie fornærmelser er vanlig i ulike pattedyr celletyper, inkludert skjelettlidelser og hjerte-muskelen, mage og lunge celler1,2,3,4. I tillegg til skader påfølgende daglig fysiologiske funksjon, kan celle membraner også bli skadet av miljømessige fornærmelser, bakteriell giftstoffer og iskemiske reperfusion5. Manglende evne til å forsegle brudd i cellemembranen fører til en uregulert strøm av ekstracellulære Ca2 +– sammen med andre potensielt giftig ekstracellulære komponenter – inn i cellen, utløser nedstrøms signal cascades som raskt kan resultere i cellen død1,4,5,6.
Hittil har det vært flere forslag modeller for membran reparasjon i celler. Forskjellige reparasjonsmekanismene kan aktiveres avhengig av størrelsen og karakteren av membran brudd. For eksempel er det foreslått at celle membraner kan benytte lateral flyt eller protein tilstopping for å reparere små forstyrrelser (< 1 nm). Lateral fusion modellen foreslår at membran brudd er raskt reparert gjennom lateral rekrutteringen av dysferlin inneholder membran7, mens protein tilstopping modellen antyder at små hullene er reparert gjennom protein samlinger (hovedsakelig annexins) 8. derimot større membran lesjoner utløse Ca2 +-avhengige, dysferlin-mediert vesicle fusion og dannelsen av en reparasjon oppdatering. Reparasjon oppdateringen modellen, utløser en rask Ca2 + tilstrømningen til cellen rekruttering av flere proteiner (dysferlin, annexins, mitsugumin-53 og EDH proteiner) som utgjør en kompleks eller “patch”, sammen med en blanding av intracellulær blemmer eller lysosomer på stedet av membran skade4,9,10,11,12. Det er viktig å merke seg at disse modellene er ikke utelukker og fungerer sammen å lette membran reparere. Unnlatelse av å riktig forsegle cellemembranen skade er forbundet med flere sykdom stater, inkludert muskeldystrofi (dysferlinopathy – inkludert Miyoshi muskeldystrofi, lem-belte muskeldystrofi type IIB og distale muskeldystrofi med fremre tibial innsettende) 13, kardiomyopati14og Chediak-Higashi syndrom (CHS)15.
Gitt at riktig cellemembranen integritet og resealing spiller så viktig rolle i helse og sykdom, en dypere forståelse av underliggende molekylære mekanismer av cellemembranen reparasjon ville være gunstig i Søk etter romanen strategier. Det er derfor nødvendig å ha eksperimentelle teknikker for å overvåke kinetics og vurdere muligheten av cellemembranen reparasjon. Flere i vitro metoder for modellering membran reparasjon er utformet. En strategi innebærer mekanisk skade som kan ordnes gjennom cellen skraping med en pipette/kirurgisk blad/barberhøvel eller ved å rulle glassperler over celler16. Men denne typen mekanisk skade genererer større lesjoner, og oppretter en høy grad av variasjon i celle skade, både innenfor og mellom kulturer.
En annen metoden å generere membran sår er laser ablasjon av to-fotonet mikroskopi. I motsetning til tradisjonelle laser AC confocal mikroskopi som sysselsetter enkelt Foton eksitasjon, bruker to-fotonet laser samtidig to lang-bølgelengde, lav-energi fotoner for å lette magnetisering av en høy-energi elektron17. Denne ikke-lineære prosessen resulterer i eksitasjon utelukkende innenfor fokalplanet og ikke langs hele lys banen17 (figur 1). Dette reduserte eksitasjon volum bidrar til å redusere photodamage når imaging lever celler18,19. Forskere er derfor kunne generere nøyaktige lesjoner i cellemembranen og skjermen membran resealing i sanntid ved å bruke fluorescerende fargestoffer og observerer endringer i fluorescens intensiteten som cellemembranen brudd og deretter reseals.
Denne tilnærmingen er brukt gjentatte ganger å studere membran såret i vitro og i vivo og flere cellen skriver20,21. For eksempel membran reparere fibroblaster og myotubes Hentet fra dysferlinopathy pasienter ble vurdert ved hjelp av denne teknikken22,23. Også ble enkelt muskelfibre isolert fra mus brukt til å overvåke reparasjon oppdateringen formasjon13,24,25. Bevegelsen av fluorescently merket proteiner kan også observeres under membranen reparasjon i enkelt muskelfibre9. Videre kan prosessen med sarcolemmal reparasjon etter to-fotonet laser såret i sebrafisk embryoer observeres i sanntid i vivo26.
I denne artikkelen skissere vi en metodikk for å vurdere celle membran reparasjon dynamikk i fibroblaster med to-fotonet laser såret, men denne metoden kan brukes på ulike celletyper for å kvantifisere plasma membran resealing evne i vitro. I denne metoden celler er ruges med FM4-64, en lipofile, celle-ugjennomtrengelig fargestoff som raskt fluoresces som det binder seg til negativt ladet fosfolipider i cytoplasma ved å skrive inn cellen gjennom membranen lesjonen (figur 2& 3). kvantifisering av fargestoff fluorescens tilstøtende membran lesjonen tillater overvåking tiden det tar for celle membran å reseal selv. Du eksemplifiserer nytten av denne metoden, bruker vi dysferlinopathy pasienten fibroblaster transfekterte med GFP-konjugerte full lengde dysferlin (DYSF) Plasmidene for å vurdere redning av cellemembranen reparasjon.
Protocol
Representative Results
Discussion
To-fotonet laser sårer cellemembranen er en presis og allsidig teknikk for å vurdere dynamikken i membranen resealing i vitro. I denne artikkelen beskrev vi en protokoll for å bestemme cellemembranen resealing evne i dysferlinopathy pasienten celler ved hjelp av to-fotonet laser såret analysen. Våre resultater viser at dysferlinopathy pasienten celler er mangelfulle i cellemembranen resealing, hvilke er gjennomført med funn av andre forskere og noe som ytterligere understreker de slående likhetene i celle…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av University of Alberta fakultet medisin og odontologi, den venner av Garrett Cumming Research stol Fund, HM Toupin nevrologiske Science Research stol Fund, muskeldystrofi Canada, Canada Foundation for innovasjon (CFI), Alberta avansert utdanning og teknologi (EEO), canadisk Institutes of Health Research (CIHR), Jesse reise – grunnlaget for Gene og cellen terapi, kvinner og barns helse Research Institute (WCHRI), og Alberta fornyer Health Solutions (AIHS ).
Vi vil gjerne takke Dr. Steven Laval for å forsyne oss med full lengde dysferlin plasmider. Vi vil også gjerne takke Dr. Katsuya Miyake for tekniske råd.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher | 25300062 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 35mm collagen-coated glass-bottom dishes | MatTek | P53GCOL-1.5-14-C | |
| Serum-deprived media | Thermo Fisher | 31985070 | |
| Transfection reagent | Thermo Fisher | 15338100 | |
| FM 4-64 Dye | Invitrogen | T13320 | |
| Tyrode’s Salts Solution | Sigma-Aldrich | T2397 | |
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | NA | |
| Chameleon Two-photon laser | Coherent | NA |
References
- Cong, X., Hubmayr, R. D., Li, C., Zhao, X. Plasma membrane wounding and repair in pulmonary diseases. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 312 (3), L371-L391 (2017).
- Demonbreun, A. R., McNally, E. M. Plasma Membrane Repair in Health and Disease. Curr Top Membr. 77, 67-96 (2016).
- McNeil, P. L., Ito, S. Gastrointestinal cell plasma membrane wounding and resealing in vivo. Gastroenterology. 96 (5 Pt 1), 1238-1248 (1989).
- McNeil, P. L., Kirchhausen, T. An emergency response team for membrane repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (6), 499-505 (2005).
- Cooper, S. T., McNeil, P. L. Membrane Repair: Mechanisms and Pathophysiology. Physiol Rev. 95 (4), 1205-1240 (2015).
- Geeraerts, M. D., Ronveaux-Dupal, M. F., Lemasters, J. J., Herman, B. Cytosolic free Ca2+ and proteolysis in lethal oxidative injury in endothelial cells. Am J Physiol. 261 (5 Pt 1), C889-C896 (1991).
- McDade, J. R., Archambeau, A., Michele, D. E. Rapid actin-cytoskeleton-dependent recruitment of plasma membrane-derived dysferlin at wounds is critical for muscle membrane repair. FASEB J. 28 (8), 3660-3670 (2014).
- Benninger, R. K., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4 (Unit 4), 11-24 (2013).
- Demonbreun, A. R., et al. An actin-dependent annexin complex mediates plasma membrane repair in muscle. J Cell Biol. 213 (6), 705-718 (2016).
- McNeil, P. L., Khakee, R. Disruptions of muscle fiber plasma membranes. Role in exercise-induced damage. Am J Pathol. 140 (5), 1097-1109 (1992).
- Rodriguez, A., Webster, P., Ortego, J., Andrews, N. W. Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells. J Cell Biol. 137 (1), 93-104 (1997).
- Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106 (2), 157-169 (2001).
- Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423 (6936), 168-172 (2003).
- Han, R., et al. Dysferlin-mediated membrane repair protects the heart from stress-induced left ventricular injury. J Clin Invest. 117 (7), 1805-1813 (2007).
- Huynh, C., Roth, D., Ward, D. M., Kaplan, J., Andrews, N. W. Defective lysosomal exocytosis and plasma membrane repair in Chediak-Higashi/beige cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (48), 16795-16800 (2004).
- Corrotte, M., Castro-Gomes, T., Koushik, A. B., Andrews, N. W. Approaches for plasma membrane wounding and assessment of lysosome-mediated repair responses. Methods Cell Biol. 126, 139-158 (2015).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Jontes, J. D., Buchanan, J., Smith, J. S. Growth cone and dendrite dynamics in zebrafish embryos: early events in synaptogenesis imaged in vivo. Nat Neurosci. 3 (3), 231-237 (2000).
- Galbraith, J. A., Terasaki, M. Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation. Mol Biol Cell. 14 (5), 1808-1817 (2003).
- McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. The endomembrane requirement for cell surface repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (8), 4592-4597 (2003).
- Weisleder, N., et al. Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems. J Vis Exp. (52), (2011).
- Matsuda, C., Kiyosue, K., Nishino, I., Goto, Y., Hayashi, Y. K. Dysferlinopathy Fibroblasts Are Defective in Plasma Membrane Repair. PLoS Curr. 7, (2015).
- Philippi, S., et al. Dysferlin-deficient immortalized human myoblasts and myotubes as a useful tool to study dysferlinopathy. PLoS Curr. 4, RRN1298 (2012).
- Cai, C., et al. MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery. Nat Cell Biol. 11 (1), 56-64 (2009).
- Swaggart, K. A., et al. Annexin A6 modifies muscular dystrophy by mediating sarcolemmal repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (16), 6004-6009 (2014).
- Roostalu, U., Strahle, U. In vivo imaging of molecular interactions at damaged sarcolemma. Dev Cell. 22 (3), 515-529 (2012).
- Azakir, B. A., et al. Modular dispensability of dysferlin C2 domains reveals rational design for mini-dysferlin molecules. J Biol Chem. 287 (33), 27629-27636 (2012).
- Lee, J., Yokota, T., Takeda, S., Miyagoe-Suzuki, Y., Mori-Yoshimura, M. Ch 6. Translational Research in Muscular Dystrophy. , 87-102 (2016).
- Barthelemy, F., Wein, N., Krahn, M., Levy, N., Bartoli, M. Translational research and therapeutic perspectives in dysferlinopathies. Mol Med. 17 (9-10), 875-882 (2011).
