전 비보 인간 면역 결핍 바이러스 1와 Histoculture 인간 림프 조직 및 여성 생식 기 점 막의 감염
Summary
인간의 조직 비보 전 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)의 감염 바이러스 병의 귀중 한 3D 모델을 제공합니다. 여기, 우리는 프로토콜 처리 및 조직 표본에서 인간의 편도 에이즈-1 여성 생식 기 거칠어 감염과 액체 공기 인터페이스에 문화에서 그들을 유지 하는 것을 설명 합니다.
Abstract
Histocultures 허용 인간의 조직 내에서 세포 상호 작용을 공부 하 고 그들은 통제 된 실험실 조건에서 모델 호스트 병원 체 상호 작용을 채택 될 수 있다. 인간의 조직 중 다른 바이러스, 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)의 감염 ex vivo 효능 및 항 바이러스 약물의 독성을 테스트 플랫폼으로 초기 질병 병 인, 조사를 성공적으로 사용 되었습니다. 현재 프로토콜에서 우리가 처리와 에이즈-1 조직 explants 인간의 편도 및 자 궁 경부 거칠어, 감염 약 2 주 동안 액체 공기 인터페이스에 젤라틴 스폰지 위에 문화에서 그들을 유지 하는 방법을 설명 합니다. 이 아닌-편광 culture 설정 조직의 무결성과 기능적 아키텍처의 진보적인 손실의 주요 제한 남아 있지만 문화 매체에 산소, 영양소에 대 한 액세스를 극대화 합니다. 이 메서드는 hiv-1 복제 및 병 인 immunoassays, cytometry, 정량, 등 여러 가지 기술을 사용 하 여 모니터링을 수 있습니다. 중요성, 생리 변화 같은 표본의 다른 지역에서 explants 사이 에서도 조직 기증자, 사이의 실험 결과 영향을 크게 수 있습니다. 결과 재현성을 보장 하기 위해, 그것은 중요 explants, 기술 복제, 조건과 일치 하는 기증자 컨트롤의 적절 한 번호를 사용 하 여 여러 실험에서 데이터를 컴파일할 때 실험적 치료의 결과 정규화 (즉, ., 다른 기증자에서 직물을 사용 하 여 실시) 통계 분석을 위해.
Introduction
여기 언급으로 종래의 monotypic bi 차원 세포 배양 조직을 구성 하는 세포 유형의 큰 다양성 및 기관 간의 공간 및 기능 통신에 대 한 계정을 하지 않습니다. 이 점은 질병의 실험 모델에 대 한 파라마운트 중요성의 방해가 homeostatic 세포 상호 작용은 모든 병 리의 운전 요인. 조직 explants 그들은 vivo에서, 비록 제한 된 양의 시간1대는 cytoarchitecture와 기관의 많은 중요 한 기능적 측면을 유지 하기 때문에 건강 및 인 간에 있는 질병을 모델링 하기 위한 주요 이점을 제공 합니다. 예를 들어 디프테리아 사망 toxoid 등 파상풍 사망 toxoid, 회 항으로 비보 전 도전 시 편도 선 조직 항 원 특정 항 체2의 활발 한 생산 응답합니다. 어떤 다른 비보 전 모델 처럼, histoculture는 그것의 자신의 제한이: 간 기증자, 조직 분극, 제한 된 조직 생존, 변화와 confocal 현미경 검사 법1의 깊이 넘어 셀 모니터링에 어려움. 그럼에도 불구 하 고, 인간의 조직 explants 호스트 병원 체 상호 작용 및 잠재적인 치료 내정간섭3를 포함 하 여 인간에서 항상성 및 병원 성 면역 과정을 공부 하는 선택의 모델을 남아 있다.
에이즈-1 병의 중요 한 이벤트는 조직에서 자리를 차지할. 생식 기 점 막의 감염 모든 hiv-1 전송 이벤트 전세계4의 대부분을 차지 한다. 림프 조직 급성 감염 시 바이러스 복제의 주요 사이트 latently 감염 세포5의 뜻깊은 수영장을 비호 하 고 그들의 지 속성 치료6을 달성 하기 위해 주요 장애물을 나타냅니다. 인간 림프 및 점 막 조직의 문화 및 비보 전 도전 에이즈-1의 연구에 대 한 격리 된 세포에 따라 기존의 시스템에 비해 몇 가지 장점을 제공 합니다. 예를 들어, 조직 상주 세포 주변 혈액 단 셀1반대로 exogenous 활성화의 부재에 에이즈-1 감염을 지원할 수 있습니다. 림프 조직 explants의 사용 기본 CD4 T 세포 소모즉, 방관자 효과7, 급성 감염의 특징은 몇 가지 주요 메커니즘의 더 나은 이해를 허용 했다. 림프 조직8 여 포 B 셀 등 여성 생식 기 점 막 explants9 상피 구조의 보전이이 사이트에서 에이즈-1 감염의 공간 및 기능 기능을 통합 독특한 기회를 제공 합니다. Antiretrovirals 및 multitarget microbicides12, 의 전 임상 시험에 대 한 뿐만 아니라 모델을 연구 및 herpesvirus 공동 감염10,11, histocultures 성공적으로 사용 되었다 마지막으로, 13 , 14 , 15.
여기, 편도 선 및 낮은 여성의 성 기 요로 (자 궁 경부)에서 점 막 조직에서 얻은 인간 조직 explants의 문화에 대 한 자세한 프로토콜 덮고 비 편광 방식으로 에이즈-1 도전 explant를 조직 해 부 설명 합니다. 문화 지원, 젤라틴 스폰지를 사용 하 여 액체 공기 인터페이스에서 조직 explants의 모세 혈관, 따라서 그들의 자연적인 감퇴를 지연 스폰지를 통해 문화 매체 영양소에 대 한 액세스를 제공 하면서 산소를 공기에 노출을 극대화 합니다. Hiv-1 복제를 평가 하는 우리의 시스템에 가장 즉각적인 방법은 immunoassay 또는 정량 시간이 지남에 explant 문화 매체에 발표 하는 바이러스의 양을 측정 하는 것입니다. 에이즈-1 감염 및 병 인 (예., CD4 T 세포 소모) cytometry 여 조직 explants 대량 RNA/DNA 추출 및 정량, 제자리에서 얼룩, 또는 조직 소화 시 단일 세포 분석 평가할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
인간의 조직 사용 explants 에이즈-1 감염의 연구는 전통적인 bi 차원 및 monotypic 실험 시스템 1 차 셀 또는 셀 라인, 세포 상호 작용 재현 하 그들의 뛰어난 능력 때문에 이점을 제공 하 고 휴대 기능 vivo에서그들은 (예를 들어, cytokine 생산). 그럼에도 불구 하 고, 편도 선 및 자 궁 경부 조직 수, 및 HIV 대상 셀1,16의 phenotypic와 기능적 특성 등 여러 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 재단 Blanceflor 본 콤 파 니 비시 옛 Bildt (http://blanceflor.se/), 에이즈 (http://www.aidsfond.se/, 참고 FOa2014-0006)와 피코 안드레아 전자 리비 Lorini (http에 대하여 재단 스웨덴 의사에서 교부 금에 의해 지원 되었다 : / / fondazionelorini.it/) 안드레아 Introini에.
Materials
| Gelfoam 12-7 mm Absorbable gelatin sponge | Pfizer | NDC: 0009-0315-08 | Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue. |
| SPONGOSTAN Standard 70 × 50 × 10 mm Absorbable haemostatic gelatin sponge | Ferrosan Medical Devices | MS0002 | Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue. |
| RPMI 1640 with phenol red and glutamine | ThermoFisher Scientific | 21875034 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Modified Eagle's medium (MEM) non-essential aminoacids (100x) | ThermoFisher Scientific | 11140035 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Sodium pyruvate, 100 mM (100x) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Gentamicin 50 mg/mL (1000x) | ThermoFisher Scientific | 15750037 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Amphotericin B 250 μg/mL (100x) | ThermoFisher Scientific | 15290018 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Fetal bovine serum (FBS) | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). | ||
| Ticarcillin disodium salt | Sigma-Aldrich | T5639-1G | Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3g) and potassium clavulanate (100mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT. |
| Potassium clavulanate | Sigma-Aldrich | 33454-100MG | Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3g) and potassium clavulanate (100mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT. |
| Sterile phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 w/o calcium, magnesium and phenol red | To use for storage and transportation of surgical specimens. PBS can be replaced with another isotonic solution with physiologic pH. Culture medium is best for overnight storage. | ||
| Sterile cell culture grade water | |||
| Sterile transportation container | |||
| 70% ethanol solution | |||
| Disinfectant solution for biological waste disposal | |||
| Sterile metal forceps or tweezers | |||
| Sterile metal scissors | |||
| Sterile flat weighing metal spatula | |||
| Sterile scalpels and blades | |||
| 6-well cell culture plates | |||
| 12-well cell culture plates | |||
| Sterile Petri dish, 100 mm × 20 mm | |||
| Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1BaL | NIH AIDS Reagent Program | 510 | The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1LAI.04 | NIH AIDS Reagent Program | 2522 | The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Lamivudine (3TC) | NIH AIDS Reagent Program | 8146 | Resuspend in DMSO at 10 mg/ml, aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Biological safety cabinet | |||
| Water-jacketed CO2 incubator, set at 37 °C, 5% CO2, ≥ 90% humidity | |||
| Water bath set at 37 °C | |||
| Sterile 1.5- and 2-mL screw cap tubes | |||
| Dry bath shaker with heating block for 1.5-mL tubes, set at 37 °C, 300 rpm |
References
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