Ex Vivo İnsan lenfoid doku ve erkek Genital mukoza insan immün yetmezlik virüsü 1 ve Histoculture ile enfeksiyonun
Summary
İnsan immün yetmezlik virüsü (HIV) ex vivo insan kurcalayarak enfeksiyon virüs Patogenez değerli bir 3D modeli sağlar. Burada, işlemek ve doku örnekleri insan bademcikler ve kadın genital mucosae HIV-1 enfekte ve kültür sıvı-AIR arabirimiyle, proje için bir protokol açıklayın.
Abstract
Hücreler arası etkileşimler insan dokularda okuyan Histocultures izin ve onlar modeli ana bilgisayar-patojen etkileşimleri kontrollü laboratuvar koşullarında için istihdam edilebilir. Ex vivo enfeksiyon ile arasında diğer virüs, insan immün yetmezlik virüsü (HIV), insan dokuların erken hastalık patogenezinde yanı sıra etkinlik ve antiviral ilaçlar toksisite test etmek için bir platform araştırmak için başarılı bir şekilde kullanılmıştır. Mevcut iletişim kuralında, biz nasıl işlemek ve HIV-1 doku explants insan bademcikler ve servikal mucosae bulaştırmak ve yaklaşık iki hafta süreyle kültür üzerine Jelatin sünger sıvı-AIR arabirimiyle, proje için açıklar. Her ne kadar doku bütünlüğü ve fonksiyonel mimarileri ilerici kaybı onun ana sınırlama kalır bu sigara polarize kültür ayarı kültür orta ve oksijen, besin erişimin en üst düzeye çıkarır. Bu yöntem, HIV-1 çoğaltma ve uzun, qPCR ve akış sitometresi dahil olmak üzere çeşitli yöntemlerle Patogenez izleme sağlar. Önemi, fizyolojik değişkenliğine doku bağışçılar arasında yanı sıra aynı örnek farklı alanlardan explants arasında deneysel sonuçlar önemli ölçüde etkileyebilir. Sonuç tekrarlanabilirlik emin olmak için deneysel tedavilerin sonuçları birden fazla deneyler veri derleme zaman normalize etmek explants, teknik çoğaltır ve donör eşlemeli denetim koşullar yeterli sayıda kullanmak için önemlidir (yani ., yapılan doku farklı bağışçılardan kullanarak) istatistiksel analiz için.
Introduction
Monotypic iki boyutlu hücre kültürleri, burada için geleneksel olarak, sevk dokuları oluşturan hücre türleri çok çeşitli ve organlar arasındaki kayma ve işlevsel iletişim için hesap yapmak. Tüm patolojiler itici faktör homeostatik hücreler arası etkileşimler ile girişim olduğu gibi bu hastalık, deneysel modeller için büyük önem yönüdür. Doku explants sınırlı bir zaman1rağmen için in vivo, oldukları gibi cytoarchitecture ve birçok önemli işlevsel açıdan organları korumak için sağlık ve hastalık insanlarda modelleme için önemli avantajlar sunuyor. Örneğin, difteri toksoidi veya tetanoz toksoidi gibi hatırlama antijenleri ile ex vivo meydan okuma üzerine Bademciklere doku antijen spesifik antikorlar2güçlü bir üretim ile birlikte yanıt verir. Başka bir ex vivo model gibi histoculture kendi sınırlamaları vardır: arası donör değişkenliği, doku polarizasyon, sınırlı doku hayatta kalma ve confocal mikroskobu1derinliği ötesinde hücreleri izleme zorluk. Yine de, insan dokusu explants bir model tercih insanlar ana bilgisayar-patojen etkileşimleri ve potansiyel terapötik müdahaleler3de dahil olmak üzere, homeostatik ve patojenik immünolojik işlemlerinde çalışmaya kalır.
HIV-1 patogenezinde önemli olaylar doku gerçekleşecek. Tüm HIV-1 iletim olaylar Dünya çapında4çoğunluğu genital mukoza hesaplarında enfeksiyonu. Lenfoid doku virüs çoğaltma sırasında akut enfeksiyon önemli sitedir ve gizlice enfekte hücreleri5önemli bir havuz limanlar ve onların kalıcı bir tedavi6elde etmek için ana engel temsil eder. İnsan lenfoid ve mukozal doku kültürü ve ex vivo meydan geleneksel sistemleri izole hücreler HIV-1 çalışma için temel bazı avantajlar sağlar. Örneğin, yerleşik doku hücreleri yokluğunda periferik kan mononükleer hücreler1aksine eksojen harekete geçirmek, HIV-1 enfeksiyonu destekleyebilir. Lenfoid doku explants kullanımı CD4 T hücre tükenmesiyani, seyirci etkisi7, akut enfeksiyon damgasını olan altta yatan bazı anahtar mekanizmaları daha iyi anlaşılmasını sağladı. B hücre köklerinin lenfoid doku8 ve epitel kadın genital mukoza explants9 gibi yapılar korunması HIV-1 enfeksiyonu bu sitelerdeki kayma ve fonksiyonel özellikleri bütünleştirmek için eşsiz bir fırsat sunmaktadır. Son olarak, histocultures başarıyla modeli ve çalışma HIV-1 ve herpesvirus Co enfeksiyon10,11yanı sıra preklinik antiretrovirals ve multitarget microbicides12, test etmek için kullanılmıştır 13 , 14 , 15.
Burada, biz meydan okuma ile HIV-1 sigara polarize bir şekilde explant için doku diseksiyon kapsayan bademcikler ve alt kadın genital sistem (serviks), mukozal doku elde edilen insan dokusu explants kültür için detaylı bir protokol tanımlamak. Doku explants olarak bir destek, Jelatin sünger kullanarak sıvı-hava arabirimi, kültür oksijen kılcal, böylece onların doğal çürüme geciktirerek kültür orta besin sünger aracılığıyla erişim sağlarken hava maruz en üst düzeye çıkarır. HIV-1 çoğaltma sistemimizde değerlendirme en acil virüs explant kültür ortamda zamanla immunoassay veya qPCR tarafından yayımlanan miktarını ölçmek için yoludur. HIV-1 enfeksiyonu ve Patogenez (Örn., CD4 T hücre tükenmesi) Ayrıca doku explants tarafından toplu RNA/DNA ekstraksiyon ve qPCR, in situ boyama veya tek hücre-doku sindirim üzerine analiz akış sitometresi tarafından değerlendirilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
İnsan dokusu kullanımını explants için HIV-1 enfeksiyonu çalışmanın geleneksel iki boyutlu ve monotypic deneysel sistemleri, primer hücre veya hücre hatları, üstün sizdirmaz kartu hücreler arası etkileşimler çoğaltmak gibi avantajlar sağlar ve vivo içindeoldukları gibi hücresel (Örneğin, sitokin üretim) çalışır. Yine de, Bademciklere ve servikal doku sayısı ve HIV hedef hücreleri1,16fenotipik ve fonksiyonel özel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Vakfı Blanceflor Boncompagni Ludovisi nee Bildt (http://blanceflor.se/), Vakfı İsveçli Doktor AIDS (http://www.aidsfond.se/, ref. FOa2014-0006) ve Fondazione Andrea e Libi Lorini (http karşı gelen hibe tarafından desteklenmiştir : / / fondazionelorini.it/) Andrea Introini için.
Materials
| Gelfoam 12-7 mm Absorbable gelatin sponge | Pfizer | NDC: 0009-0315-08 | Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue. |
| SPONGOSTAN Standard 70 × 50 × 10 mm Absorbable haemostatic gelatin sponge | Ferrosan Medical Devices | MS0002 | Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue. |
| RPMI 1640 with phenol red and glutamine | ThermoFisher Scientific | 21875034 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Modified Eagle's medium (MEM) non-essential aminoacids (100x) | ThermoFisher Scientific | 11140035 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Sodium pyruvate, 100 mM (100x) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Gentamicin 50 mg/mL (1000x) | ThermoFisher Scientific | 15750037 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Amphotericin B 250 μg/mL (100x) | ThermoFisher Scientific | 15290018 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Fetal bovine serum (FBS) | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). | ||
| Ticarcillin disodium salt | Sigma-Aldrich | T5639-1G | Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3g) and potassium clavulanate (100mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT. |
| Potassium clavulanate | Sigma-Aldrich | 33454-100MG | Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3g) and potassium clavulanate (100mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT. |
| Sterile phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 w/o calcium, magnesium and phenol red | To use for storage and transportation of surgical specimens. PBS can be replaced with another isotonic solution with physiologic pH. Culture medium is best for overnight storage. | ||
| Sterile cell culture grade water | |||
| Sterile transportation container | |||
| 70% ethanol solution | |||
| Disinfectant solution for biological waste disposal | |||
| Sterile metal forceps or tweezers | |||
| Sterile metal scissors | |||
| Sterile flat weighing metal spatula | |||
| Sterile scalpels and blades | |||
| 6-well cell culture plates | |||
| 12-well cell culture plates | |||
| Sterile Petri dish, 100 mm × 20 mm | |||
| Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1BaL | NIH AIDS Reagent Program | 510 | The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1LAI.04 | NIH AIDS Reagent Program | 2522 | The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Lamivudine (3TC) | NIH AIDS Reagent Program | 8146 | Resuspend in DMSO at 10 mg/ml, aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Biological safety cabinet | |||
| Water-jacketed CO2 incubator, set at 37 °C, 5% CO2, ≥ 90% humidity | |||
| Water bath set at 37 °C | |||
| Sterile 1.5- and 2-mL screw cap tubes | |||
| Dry bath shaker with heating block for 1.5-mL tubes, set at 37 °C, 300 rpm |
References
- Grivel, J. C., Margolis, L. Use of human tissue explants to study human infectious agents. Nature protoc. 4 (2), 256-269 (2009).
- Glushakova, S., Grivel, J. C., Fitzgerald, W., Sylwester, A., Zimmerberg, J., Margolis, L. B. Evidence for the HIV-1 phenotype switch as a causal factor in acquired immunodeficiency. Nat Med. 4 (2), 346-349 (1998).
- Dezzutti, C. S. Animal and human mucosal tissue models to study HIV biomedical interventions: can we predict success. J Int AIDS Soc. 18 (1), 20301 (2015).
- Lederman, M. M., Margolis, L. The lymph node in HIV pathogenesis. Semin Immunol. 20 (3), 187-195 (2008).
- Chun, T. W., Moir, S., Fauci, A. S. HIV reservoirs as obstacles and opportunities for an HIV cure. Nat Immunol. 16 (6), 584-589 (2015).
- Biancotto, A., et al. HIV-1 induced activation of CD4+ T cells creates new targets for HIV-1 infection in human lymphoid tissue ex vivo. Blood. 111 (2), 699-704 (2008).
- Van Laar, J. M., et al. Sustained secretion of immunoglobulin by long-lived human tonsil plasma cells. Am J Pathol. 171 (3), 917-927 (2007).
- Introini, A., et al. Seminal plasma induces inflammation and enhances HIV-1 replication in human cervical tissue explants. PLoS Pathog. 13 (5), 1006402 (2017).
- Grivel, J. C., et al. Suppression of CCR5- but not CXCR4-tropic HIV-1 in lymphoid tissue by human herpesvirus 6. Nat Med. 7 (11), 1232-1235 (2001).
- Rollenhagen, C., Lathrop, M. J., Macura, S. L., Doncel, G. F., Asin, S. N. Herpes simplex virus type-2 stimulates HIV-1 replication in cervical tissues: implications for HIV-1 transmission and efficacy of anti-HIV-1 microbicides. Mucosal Immunol. 7 (5), 1165-1174 (2014).
- Lisco, A., et al. Acyclovir is activated into a HIV-1 reverse transcriptase inhibitor in herpesvirus-infected human tissues. Cell Host Microbe. 4 (3), 260-270 (2008).
- Vanpouille, C., et al. A common anti-cytomegalovirus drug, ganciclovir, inhibits HIV-1 replication in human tissues ex vivo. AIDS. 31 (11), 1519-1528 (2017).
- Andrei, G., et al. Topical tenofovir, a microbicide effective against HIV, inhibits herpes simplex virus-2 replication. Cell Host Microbe. 10 (4), 379-389 (2011).
- Greenhead, P., Hayes, P., Watts, P. S., Laing, K. G., Griffin, G. E., Shattock, R. J. Parameters of human immunodeficiency virus infection of human cervical tissue and inhibition by vaginal virucides. J Virol. 74 (12), 5577-5586 (2012).
- Saba, E., et al. HIV-1 sexual transmission: early events of HIV-1 infection of human cervico-vaginal tissue in an optimized ex vivo model. Mucosal Immunol. 3 (3), 280-290 (2010).
- Introini, A., Vanpouille, C., Lisco, A., Grivel, J. C., Margolis, L. Interleukin-7 facilitates HIV-1 transmission to cervico-vaginal tissue ex vivo. PLoS Pathog. 9 (2), 1003148 (2013).
- Biancotto, A., et al. A highly sensitive and dynamic immunofluorescent cytometric bead assay for the detection of HIV-1 p24. J Virol Methods. 157 (1), 98-101 (2009).
- Lisco, A., Vanpouille, C., Margolis, L. War and peace between microbes: HIV-1 interactions with coinfecting viruses. Cell Host Microbe. 6 (5), 403-408 (2009).
- Keele, B. F., et al. Identification and characterization of transmitted and early founder virus envelopes in primary HIV-1 infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (21), 7552-7557 (2008).
- Pudney, J., Quayle, A. J., Anderson, D. J. Immunological microenvironments in the human vagina and cervix: mediators of cellular immunity are concentrated in the cervical transformation zone. Biol Reprod. 73 (6), 1253-1263 (2005).
- Ganor, Y., et al. Within 1h, HIV-1 uses viral synapses to enter efficiently the inner, but not outer, foreskin mucosa and engages Langerhans-T cell conjugates. Mucosal Immunol. 3 (5), 506-522 (2010).
- Cavarelli, M., Foglieni, C., Rescigno, M., Scarlatti, G. R5 HIV-1 envelope attracts dendritic cells to cross the human intestinal epithelium and sample luminal virions via engagement of the CCR5. EMBO Mol Med. 5 (5), 776-794 (2013).
- Cummins, J. E., et al. Preclinical testing of candidate topical microbicides for anti-human immunodeficiency virus type 1 activity and tissue toxicity in a human cervical explant culture. Antimicrob Agents Chemother. 51 (5), 1770-1779 (2007).
- Abner, S. R., et al. A human colorectal explant culture to evaluate topical microbicides for the prevention of HIV infection. J Infect Dis. 192 (9), 1545-1556 (2005).
- Saba, E., et al. Productive HIV-1 infection of human cervical tissue ex vivo is associated with the secretory phase of the menstrual cycle. Mucosal Immunol. 6 (6), 1081-1090 (2013).
