Ex Vivo Infección de la Mucosa Genital tejido linfoide humano y mujer con Virus de inmunodeficiencia humana 1 y Histoculture
Summary
Infección de tejidos humanos con virus de inmunodeficiencia humana (VIH) ex vivo proporciona un valioso modelo 3D de la patogenesia virus. Aquí, describimos un protocolo e infectar a los especímenes del tejido de las amígdalas humanas y de la mucosa genital femenina con HIV-1 y mantener en la cultura en la interfase líquido-aire.
Abstract
Histocultures permite estudiar interacciones intercelulares en tejidos humanos, y emplearon a huésped-patógeno modelo bajo condiciones controladas de laboratorio. Infección ex vivo de tejidos humanos con virus de inmunodeficiencia humana (VIH), entre otros virus, se ha utilizado con éxito para investigar la patogénesis de la enfermedad temprana, así como una plataforma para probar la eficacia y la toxicidad de los fármacos antivirales. En el presente Protocolo, se explica cómo procesar e infectar con VIH-1 explantes de tejido de las amígdalas humanas y de la mucosa cervical y mantenerlas en cultivo sobre esponjas de gelatina en la interfase aire-líquido durante unas dos semanas. Esta configuración no polarizado cultura maximiza acceso a nutrientes en el medio de cultivo y oxígeno, aunque la pérdida progresiva de la integridad del tejido y arquitecturas funcionales sigue siendo su principal limitación. Este método permite el control de la replicación del VIH-1 y la patogenesia usando varias técnicas, incluyendo las immunoassays, qPCR y citometría de flujo. De importancia, la variabilidad fisiológica entre los donadores de tejidos, así como explantes de diferentes áreas de la misma muestra, puede afectar significativamente los resultados experimentales. Para asegurar la reproducibilidad del resultado, es fundamental utilizar un número adecuado de explantes, repeticiones técnicas y condiciones de control donantes emparejados para normalizar los resultados de los tratamientos experimentales al compilar datos de múltiples experimentos (es decir, ., realizado con tejido de donantes diferentes) para el análisis estadístico.
Introduction
Cultivos de células bidimensionales monotypic, mencionados aquí como convencionales, no tienen en cuenta la comunicación espacial y funcional entre la gran variedad de tipos celulares que componen los tejidos y órganos. Este aspecto es de suma importancia para los modelos experimentales de enfermedad, como interferir en las interacciones intercelulares homeostáticas es el factor de manejo de patologías de todos. Explantes de tejido ofrecen grandes ventajas para el modelado de salud y enfermedad en los seres humanos porque conservan la Citoarquitectura y muchos importantes aspectos funcionales de los órganos como lo son en vivo, aunque para una cantidad limitada de tiempo1. Por ejemplo, en ex vivo reto con antígenos de recuerdo, como toxoide diftérico o toxoide tetánico, tejido amigdalino responde con una vigorosa producción de anticuerpos antígeno específicos2. Como cualquier otro ex vivo modelo, histoculture tiene sus propias limitaciones: variabilidad entre donante, polarización de tejido, tejido limitada supervivencia y dificultad en el seguimiento de células más allá de la profundidad de la microscopia confocal1. No obstante, los explantes de tejidos humanos siguen un modelo de elección para el estudio de procesos inmunológicos homeostáticos y patógenos en los seres humanos, incluyendo las interacciones huésped-patógeno y posibles intervenciones terapéuticas3.
Los eventos críticos de la patogénesis del VIH-1 tienen lugar en los tejidos. Infección de la mucosa genital representa para la mayoría de los VIH-1 transmisión eventos en todo el mundo4. Tejido linfoide es el principal sitio de replicación del virus durante la infección aguda y alberga una piscina significativa de células infectadas latente5, y su persistencia representa el principal obstáculo para lograr una curación6. El reto de cultura y ex vivo de tejidos linfoides y de la mucosas humanos ofrecen algunas ventajas sobre sistemas convencionales basados en células aisladas para el estudio del VIH-1. Por ejemplo, las células residentes del tejido pueden apoyar la infección HIV-1 en ausencia de activación exógena, a diferencia de las células mononucleares de sangre periférica1. El uso de explantes de tejido linfoide ha permitido una mejor comprensión de algunos mecanismos claves subyacentes T CD4 célula agotamientoes decir, el efecto espectador7, que es el sello de la infección aguda. La preservación de estructuras como folículos de células B en tejidos linfoides8 y el epitelio en explantes de mucosa genital femenina9 ofrece la oportunidad única de integrar características espaciales y funcionales de la infección VIH-1 en estos sitios. Finalmente, histocultures fueron utilizados con éxito al modelo y estudio de10,de coinfección VIH-1 y herpesvirus11, así como para ensayos preclínicos de antirretrovirales y multitarget microbicidas12, 13 , 14 , 15.
Aquí, describimos un protocolo detallado para el cultivo de explantes de tejido humano Obtenido de las amígdalas y mucosas del tracto genital femenino inferior (cuello uterino), cubriendo la disección del tejido para explante desafío con HIV-1 en una forma no polarizada. El cultivo de explantes de tejido en la interfase líquido-aire, utilizando esponjas de gelatina como soporte, maximiza la exposición al oxígeno de aire mientras que proporciona acceso a los nutrientes del medio de cultivo a través de la esponja capilares, retrasando así su descomposición natural. La más inmediata forma de evaluar la replicación del VIH-1 en nuestro sistema es medir la cantidad de virus liberado en el medio de cultivo de explantes con el tiempo por inmunoensayo o qPCR. Infección por VIH-1 y la patogenesia (e.g., depleción de células T CD4) también puede evaluarse en explantes de tejido por la masiva extracción de ARN/ADN y qPCR en situ tinción y análisis de célula única a digestión de tejido mediante citometría de flujo.
Protocol
Representative Results
Discussion
El uso de tejido humano explantes para el estudio de la infección VIH-1 proporciona ventajas sobre los tradicionales sistemas experimentales bidimensional y monotípicos, como células primarias o líneas celulares, debido a su capacidad superior para reproducir las interacciones intercelulares y celular (p. ej., producción de citoquinas) funciona como en vivo. Sin embargo, tejido tonsillar y cervical difieren en muchos aspectos incluyendo el número y características fenotípicas y funcionales de VI…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Blanceflor Boncompagni Ludovisi nee Bildt (http://blanceflor.se/), los médicos suecos de la Fundación contra el SIDA (http://www.aidsfond.se/, Ref. FOa2014-0006) y Fondazione Andrea e Libi Lorini (http : / / fondazionelorini.it/) a Andrea Introini.
Materials
| Gelfoam 12-7 mm Absorbable gelatin sponge | Pfizer | NDC: 0009-0315-08 | Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue. |
| SPONGOSTAN Standard 70 × 50 × 10 mm Absorbable haemostatic gelatin sponge | Ferrosan Medical Devices | MS0002 | Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue. |
| RPMI 1640 with phenol red and glutamine | ThermoFisher Scientific | 21875034 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Modified Eagle's medium (MEM) non-essential aminoacids (100x) | ThermoFisher Scientific | 11140035 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Sodium pyruvate, 100 mM (100x) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Gentamicin 50 mg/mL (1000x) | ThermoFisher Scientific | 15750037 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Amphotericin B 250 μg/mL (100x) | ThermoFisher Scientific | 15290018 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Fetal bovine serum (FBS) | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). | ||
| Ticarcillin disodium salt | Sigma-Aldrich | T5639-1G | Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3g) and potassium clavulanate (100mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT. |
| Potassium clavulanate | Sigma-Aldrich | 33454-100MG | Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3g) and potassium clavulanate (100mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT. |
| Sterile phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 w/o calcium, magnesium and phenol red | To use for storage and transportation of surgical specimens. PBS can be replaced with another isotonic solution with physiologic pH. Culture medium is best for overnight storage. | ||
| Sterile cell culture grade water | |||
| Sterile transportation container | |||
| 70% ethanol solution | |||
| Disinfectant solution for biological waste disposal | |||
| Sterile metal forceps or tweezers | |||
| Sterile metal scissors | |||
| Sterile flat weighing metal spatula | |||
| Sterile scalpels and blades | |||
| 6-well cell culture plates | |||
| 12-well cell culture plates | |||
| Sterile Petri dish, 100 mm × 20 mm | |||
| Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1BaL | NIH AIDS Reagent Program | 510 | The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1LAI.04 | NIH AIDS Reagent Program | 2522 | The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Lamivudine (3TC) | NIH AIDS Reagent Program | 8146 | Resuspend in DMSO at 10 mg/ml, aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Biological safety cabinet | |||
| Water-jacketed CO2 incubator, set at 37 °C, 5% CO2, ≥ 90% humidity | |||
| Water bath set at 37 °C | |||
| Sterile 1.5- and 2-mL screw cap tubes | |||
| Dry bath shaker with heating block for 1.5-mL tubes, set at 37 °C, 300 rpm |
References
- Grivel, J. C., Margolis, L. Use of human tissue explants to study human infectious agents. Nature protoc. 4 (2), 256-269 (2009).
- Glushakova, S., Grivel, J. C., Fitzgerald, W., Sylwester, A., Zimmerberg, J., Margolis, L. B. Evidence for the HIV-1 phenotype switch as a causal factor in acquired immunodeficiency. Nat Med. 4 (2), 346-349 (1998).
- Dezzutti, C. S. Animal and human mucosal tissue models to study HIV biomedical interventions: can we predict success. J Int AIDS Soc. 18 (1), 20301 (2015).
- Lederman, M. M., Margolis, L. The lymph node in HIV pathogenesis. Semin Immunol. 20 (3), 187-195 (2008).
- Chun, T. W., Moir, S., Fauci, A. S. HIV reservoirs as obstacles and opportunities for an HIV cure. Nat Immunol. 16 (6), 584-589 (2015).
- Biancotto, A., et al. HIV-1 induced activation of CD4+ T cells creates new targets for HIV-1 infection in human lymphoid tissue ex vivo. Blood. 111 (2), 699-704 (2008).
- Van Laar, J. M., et al. Sustained secretion of immunoglobulin by long-lived human tonsil plasma cells. Am J Pathol. 171 (3), 917-927 (2007).
- Introini, A., et al. Seminal plasma induces inflammation and enhances HIV-1 replication in human cervical tissue explants. PLoS Pathog. 13 (5), 1006402 (2017).
- Grivel, J. C., et al. Suppression of CCR5- but not CXCR4-tropic HIV-1 in lymphoid tissue by human herpesvirus 6. Nat Med. 7 (11), 1232-1235 (2001).
- Rollenhagen, C., Lathrop, M. J., Macura, S. L., Doncel, G. F., Asin, S. N. Herpes simplex virus type-2 stimulates HIV-1 replication in cervical tissues: implications for HIV-1 transmission and efficacy of anti-HIV-1 microbicides. Mucosal Immunol. 7 (5), 1165-1174 (2014).
- Lisco, A., et al. Acyclovir is activated into a HIV-1 reverse transcriptase inhibitor in herpesvirus-infected human tissues. Cell Host Microbe. 4 (3), 260-270 (2008).
- Vanpouille, C., et al. A common anti-cytomegalovirus drug, ganciclovir, inhibits HIV-1 replication in human tissues ex vivo. AIDS. 31 (11), 1519-1528 (2017).
- Andrei, G., et al. Topical tenofovir, a microbicide effective against HIV, inhibits herpes simplex virus-2 replication. Cell Host Microbe. 10 (4), 379-389 (2011).
- Greenhead, P., Hayes, P., Watts, P. S., Laing, K. G., Griffin, G. E., Shattock, R. J. Parameters of human immunodeficiency virus infection of human cervical tissue and inhibition by vaginal virucides. J Virol. 74 (12), 5577-5586 (2012).
- Saba, E., et al. HIV-1 sexual transmission: early events of HIV-1 infection of human cervico-vaginal tissue in an optimized ex vivo model. Mucosal Immunol. 3 (3), 280-290 (2010).
- Introini, A., Vanpouille, C., Lisco, A., Grivel, J. C., Margolis, L. Interleukin-7 facilitates HIV-1 transmission to cervico-vaginal tissue ex vivo. PLoS Pathog. 9 (2), 1003148 (2013).
- Biancotto, A., et al. A highly sensitive and dynamic immunofluorescent cytometric bead assay for the detection of HIV-1 p24. J Virol Methods. 157 (1), 98-101 (2009).
- Lisco, A., Vanpouille, C., Margolis, L. War and peace between microbes: HIV-1 interactions with coinfecting viruses. Cell Host Microbe. 6 (5), 403-408 (2009).
- Keele, B. F., et al. Identification and characterization of transmitted and early founder virus envelopes in primary HIV-1 infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (21), 7552-7557 (2008).
- Pudney, J., Quayle, A. J., Anderson, D. J. Immunological microenvironments in the human vagina and cervix: mediators of cellular immunity are concentrated in the cervical transformation zone. Biol Reprod. 73 (6), 1253-1263 (2005).
- Ganor, Y., et al. Within 1h, HIV-1 uses viral synapses to enter efficiently the inner, but not outer, foreskin mucosa and engages Langerhans-T cell conjugates. Mucosal Immunol. 3 (5), 506-522 (2010).
- Cavarelli, M., Foglieni, C., Rescigno, M., Scarlatti, G. R5 HIV-1 envelope attracts dendritic cells to cross the human intestinal epithelium and sample luminal virions via engagement of the CCR5. EMBO Mol Med. 5 (5), 776-794 (2013).
- Cummins, J. E., et al. Preclinical testing of candidate topical microbicides for anti-human immunodeficiency virus type 1 activity and tissue toxicity in a human cervical explant culture. Antimicrob Agents Chemother. 51 (5), 1770-1779 (2007).
- Abner, S. R., et al. A human colorectal explant culture to evaluate topical microbicides for the prevention of HIV infection. J Infect Dis. 192 (9), 1545-1556 (2005).
- Saba, E., et al. Productive HIV-1 infection of human cervical tissue ex vivo is associated with the secretory phase of the menstrual cycle. Mucosal Immunol. 6 (6), 1081-1090 (2013).
