Summary
Infektion av mänskliga vävnader med humant immunbristvirus (HIV) ex vivo ger en värdefull 3D modell av virus patogenes. Här beskriver vi ett protokoll för att bearbeta och infektera vävnadsprover från mänskliga tonsiller och kvinnliga genitala slemhinnor med HIV-1 och underhålla dem kultur i gränssnittet vätska-luft.
Abstract
Histocultures att studera intercellulära interaktioner inom mänskliga vävnader, och de kan användas till modell värd-patogen interaktioner under kontrollerade laboratorieförhållanden. Ex vivo infektion av mänskliga vävnader med humant immunbristvirus (HIV), bland andra virus, har använts framgångsrikt att undersöka tidiga sjukdomspatogenes, samt en plattform för att testa effekt och toxicitet av antivirala läkemedel. I detta protokoll förklarar vi hur du bearbetar och infektera med HIV-1 vävnad bladsticklingar från mänskliga tonsiller och cervikal slemhinnor, och upprätthålla dem i kultur ovanpå Gelatinsvampar på gränssnittet vätska-luft för ungefär två veckor. Inställningen icke-polariserat kultur maximerar tillgång till näring i odlingsmedium och syre, även om progressiv förlust av vävnad integritet och funktionella arkitekturer förblir dess huvudsakliga begränsning. Denna metod tillåter övervakning av HIV-1 replikering och patogenes med hjälp av flera tekniker, inklusive immunanalyser, qPCR och flödescytometri. Av betydelse, kan fysiologiska variabiliteten mellan vävnad givare samt mellan bladsticklingar från olika delar av samma prov, avsevärt påverka experimentella resultat. För att säkerställa resultatet reproducerbarhet, är det viktigt att använda ett tillräckligt antal bladsticklingar, tekniska replikat och givare-matchade kontroll villkor för att normalisera resultaten av de experimentella behandlingarna när sammanställa data från flera experiment (dvs ., genomförda använda vävnad från olika givare) för statistisk analys.
Introduction
Monotypiskt bi-dimensionell cellkulturer, här avses som konventionella, ska inte redogöra för den rumsliga och funktionella kommunikationen mellan den stora mängden celltyper som komponera vävnader och organ. Denna aspekt är av avgörande betydelse för experimentella modeller av sjukdom, störningar med homeostatiska intercellulära interaktioner är den drivande faktorn av alla patologier. Vävnaden bladsticklingar erbjuder stora fördelar för modellering hälsa och sjukdom hos människor eftersom de behåller cytoarchitecture och många viktiga funktionella aspekter av organ som de är i vivo, men för en begränsad mängd tid1. Exempelvis vid ex vivo utmaning med recall antigener, såsom difteritoxoid eller tetanustoxoid, svarar tonsillar vävnad med en kraftig produktion av antigen-specifika antikroppar2. Som någon annan ex vivo modell, histoculture har sina egna begränsningar: mellan givare variabilitet, vävnad polarisering, begränsad vävnad överlevnad och svårigheter att övervaka celler utöver djupet av konfokalmikroskopi1. Mänsklig vävnad bladsticklingar är ändå en modell av val att studera homeostatiska och patogena immunologiska processer hos människor, inklusive värd-patogen interaktioner och potentiella terapeutiska interventioner3.
HIV-1 patogenes kritiska händelser äga rum i vävnader. Infektion av genitalslemhinnan räkenskaperna för majoriteten av alla HIV-1 överföring händelser i världen4. Lymfatisk vävnad är stora platsen för virusreplikation under akut infektion och hamnar en stor pool av latent infekterade celler5och persistens representerar det främsta hindret för uppnå en bota6. Kultur och ex vivo utmaningen av mänskliga lymfoida och slemhinnor vävnader ger vissa fördelar gentemot konventionella system baserat på isolerade celler för studier av HIV-1. Vävnad-bosatt celler kan stöder exempelvis HIV-1 infektion i avsaknad av exogena aktivering, i motsats till perifera mononukleära blodceller1. Användning av lymfoid vävnad bladsticklingar har möjliggjort en bättre förståelse för vissa viktiga mekanismerna bakom CD4 T cell utarmningdet vill säga, den åskådare effekt7, vilket är kännetecknande för akut infektion. Bevarandet av strukturer som B-cell folliklar i lymfoid vävnad8 och epitelet i kvinnliga genitalslemhinna bladsticklingar9 erbjuder en unik möjlighet att integrera rumsliga och funktionella funktioner för HIV-1 infektion vid dessa platser. Slutligen, histocultures användes framgångsrikt till modell och studie HIV-1 och herpesvirus samtidig infektion10,11, liksom för preklinisk testning av antiretrovirala och multitarget mikrobicider12, 13 , 14 , 15.
Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för kulturen i mänsklig vävnad bladsticklingar erhållits från tonsiller och slemhinnor vävnad från lägre kvinnliga könsorganen (livmoderhals), som omfattar vävnad dissektion för att explant utmaning med HIV-1 i ett icke-polariserat sätt. Kulturen av vävnad bladsticklingar på det flytande-luft-gränssnittet med Gelatinsvampar som ett stöd, maximerar exponeringen för att luften syre samtidigt som den ger tillgång till odlingsmediet näringsämnen genom svampen kapillärer, därmed fördröja deras naturliga förfall. Det mest direkta sättet att utvärdera HIV-1 replikering i vårt system är att mäta mängden virus släppt explant odlingssubstratet över tid av immunoassay eller qPCR. HIV-1-infektion och patogenes (t.ex., CD4 T cell utarmning) kan också utvärderas i vävnad bladsticklingar av bulk RNA/DNA-extraktion och qPCR, i situ färgning eller enda cell-analys vid vävnad matsmältningen av flödescytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokoll för insamling av mänskliga vävnader kan kräva etisk godkännande av de lokala behöriga myndigheterna. Vid angivna operationer såsom tonsillektomi och hysterektomi, exemplaren samlas inte speciellt för forskning ändamål och studien anses inte vara försökspersoner forskning (National Institutes of Health. Forskning på människor. https://humansubjects.NIH.gov/Walkthrough-Investigator#tabpanel11). Dock erhålla vävnad givarnas personliga och medicinska data (t.ex., kön, ålder, nuvarande narkotikamissbruk, historia av infektioner, etc.) som kan hjälpa till att tolka experimentella resultat, poser farhågor om informerat samtycke och sekretess som måste vara tas upp i protokollet för vävnad samling.
Försiktighet: Hela förfarandet bör utföras i biologiska säkerhetsdragskåp. Alla mänskliga exemplar, inklusive de från ”friska” individer, kan hysa smittämnen. Operatören bör få utbildning att arbeta med blodburna patogener att säkert hantera vävnadsprover, även om experiment inte inbegriper användning av HIV. En riskbedömning av tillvägagångssättet av vävnad dissektion och infektion med HIV bör utföras av utbildad personal för att garantera säkerheten för operatören och medarbetare. Användning av infektiöst HIV kräver dedikerad biosäkerhet nivå 2 eller 3 miljöer beroende på land och institute-specifika föreskrifter om farliga biologicals och blodburna patogener.
1. beredning av Gelatinsvampar
Obs: Även om det inte är absolut nödvändigt för att förbereda Gelatinsvampar innan vävnad dissektion, det är mer praktiskt att följa den ordning som beskrivs här, särskilt när du hanterar en stor mängd vävnad och/eller från många givare.
- Förbereda odlingsmedium (CM) och komplettera med antibiotika lösning (Tircacillin-klavulanat mix) före användning att göra CMT (Tabell för material). Kassera överbliven antibiotika lösning.
Obs: Ticarcillin och klavulanat i CMT är dåligt stabila. Om det behövs nytt komplettera CMT med antibiotika lösning efter ca 24 h från beredning. Det krävs inte att lägga till antibiotika lösning för att explant medium varje 24 h under kultur. - Fyll en 100 mm x 20 mm petriskål med ca 20 – 30 mL av CMT.
Obs: Denna inställning är optimalt att förbereda tillräckligt Gelatinsvampar för två 6-väl plattor eller en 12-well platta på gång. Om många tallrikar krävs, Använd en bredare petriskål och större CMT volym för att påskynda förberedelserna. - Över den gelatin sponge(s) till petriskål med steril pincett. Blöt svampar på båda sidor och låt de svampar att insupa medium för 1 min. Tryck på svampar mot botten av petriskål i ca 2 min med hjälp av en steril spatel.
Obs: Detta steg är av avgörande betydelse eftersom närvaron av luftbubblor i svampen kommer att blockera kapillärer genom vilken odlingsmedium näringsämnen når vävnaden. Gelatinsvampar är extremt sprött när uttorkad. Tryck försiktigt på svampen med spateln, särskilt i början, att undvika att bryta svampen. - Använd steril sax att klippa de återfuktad Gelatinsvampar i bitar lika stora ca 1 cm2. Överföra 1 svamp bit med pincett till varje brunn kultur platta. Tillsätt 3-4 mL CMT i varje brunn 6-well platta (tonsillerna) och 1 mL per brunn till en 12-well platta (livmoderhals). Placera plåtarna i inkubatorn, Ställ vid 37 ° C, 5% CO2, ≥ 90% luftfuktighet, tills de vävnad bladsticklingar är redo att lastas på svampar.
Obs: Volymen av CMT att lägga in plattan bör justeras till tjockleken på svampen att hålla bladsticklingar på gränssnittet vätska-luft.
2. dissektion av mänsklig Tonsillar vävnad
Obs: Tonsiller bör behandlas så snart som möjligt efter operation, helst samma dag som operationen. Alternativt, exemplaren kan vara kvar över natten nedsänkt i CMT vid 4 ° C.
- Tillåt CM tillräckligt med tid att nå rumstemperatur (RT) eller placera den i ett vattenbad värmas före vid 37 ° C. Komplettera CM med antibiotika lösning (CMT) före användning. Kassera all antibiotika lösning kvar. Häll 70% etanol lösningen i en ren behållare i blöt pincett och skalpell när det behövs under förfarandet för dissektion. Rengör verktyg och ändra skalpell bladet mellan dissektioner av exemplar från olika givare.
- Över tonsiller från behållaren för transport till en 100 mm-petriskål innehållande 10-20 mL CMT med steril pincett.
Obs: Exemplar med utbredda områden med flamberats, blodig eller nekrotisk vävnad ska kasseras. - Använd locket på petriskål som en skärande yta för att dissekera vävnad. Håller vävnaden försiktigt med pincett, skär varje tonsill i flera stora bitar med steril skalpell och blad.
Försiktighet: Hantering vassa verktyg att dissekera mänskliga prover ökar risken för skador och nedsmutsning. Operatören bör bära metall, mesh, skärbeständiga handskar som extra skydd. - Ta bort flamberats, blodiga, och fibrös vävnad och några delar som innehåller tonsilloliths (förkalkade material) eller med grön-brun färg med hjälp av pincetten och skalpell.
Obs: Medan du arbetar på en bit vävnad, det är viktigt att hålla resten av vävnaden nedsänkt i medium att undvika vävnad uttorkning. - Skär varje vävnad bit i skivor ca 2 mm i tjocklek. Ta bort oönskade delar som i föregående steg. Strimlat vävnad skivor 2 mm tjock. Skär vävnad remsorna i 2 mm tjock kvarter. Detta bör resultera i vävnad bladsticklingar ungefär 8 mm3.
- Över bladsticklingar till en nya 100 mm petriskål innehållande 10 – 20 mL CMT att undvika vävnad uttorkning samtidigt fortsätter med dissektion. I slutet av dissektion, snurra på plattan för att Slumpa explant distribution. Plats 9 vävnad explants ovanpå varje gelatinsvamp i en 6-well platta med pincett, så att utrymmet mellan dem. Tillbaka plåtarna till inkubatorn.
Obs: Vanligtvis bladsticklingar odlas över natten och inympning av kulturer med HIV-1 utförs nästa dag. Detta är att se till att ingen bakterie- eller svampinfektioner förorening utvecklar i kulturen. Dessutom tenderar celler att avstigning tonsillar vävnad bladsticklingar efter dissektion. Denna process är i stort sett klar inom de första 24 h kultur1. - Kassera alla biologiskt avfall i träffande behållare enligt institutets föreskrifter om hantering av farliga biologicals och särskilda riskbedömningen.
3. infektion av Tonsillar vävnad Explants med HIV-1
Obs: För att minska resultatet variabiliteten mellan oberoende experiment, den samma virus ska användas för en hela studien. Virus kan spridas i exogent aktiverade perifera mononukleära blodceller och då kulturen supernatant kan vara aliquoted för lagring vid-80 ° C att undvika upprepad frysning och upptining (Tabell för material).
- Sätta CM i vattenbad pre värmas vid 37 ° C. Komplettera CM med antibiotika lösning (CMT) före användning. Kassera överbliven antibiotika lösning.
- Sug ut mediet i den 6-väl skylt(ar) med en pipett och kasta den i en behållare med desinficerande lösning. Luta plattan och försiktigt trycka Gelatinsvampar till den övre delen av brunnen för att tillåta mediet att samlas på botten, och aspirera och kasta den. Tillsätt 3-4 mL CMT till varje brunn.
- Tina HIV-1-virus preparatet i vattenbad vid 37 ° C. Vid behov späd virus beståndet med CM (tabell 1).
Obs: Virus beståndet bör spädas så att det valda inokulatet ingår i en volym på 5 – 8 µL (tabell 1). För en effektiv infektion är det viktigt att använda den minsta tid som krävs mellan upptining HIV-1 beredning och infektera vävnad bladsticklingar. - Pipettera det virus inokulatet direkt på toppen av varje av de 9 bladsticklingar på en gelatinsvamp. Tillbaka skylt(ar) till inkubatorn så snart infektionen är klar. Kassera någon kvarstående virus beredning. Fortsätt till avsnitt 5.
Obs: För att leverera exakt det virus inokulatet operatören bör använda en omvänd pipettering teknik och ändra tipset för varje brunn. Detta inbegriper att trycka pipett kolven nedåt till purge läge (den andra hållplatsen) att utarbeta det virus inokulatet och driver till första stoppet att leverera den inokulatet, som hjälper till att minimera bubbla bildandet och felet är associerad med upprepad provtagning av små volymer, dvs, 5 – 8 µL.
4. dissektion och infektion i livmodern livmoderhalsens slemhinna
Obs: För optimalt resultat, bladsticklingar av livmoderhalscancer slemhinnor bör bearbetas och infekterade så snart som möjligt efter operation, helst samma dag som operationen. Alternativt kan exemplar förvaras nedsänkt i CMT vid 4 ° C över natten, och infekterade omedelbart efter dissektion.
- Tillåt CM tillräckligt med tid att nå RT eller lägga den i ett vattenbad värmas före vid 37 ° C. Komplettera CM med antibiotika lösning (CMT) före användning. Kassera överbliven antibiotika lösning. Häll 70% etanol lösningen i en ren behållare att suga den pincett och skalpell när det behövs under förfarandet för dissektion. Rengör verktyg och ändra skalpell bladet mellan dissektioner av prover från flera givare.
- Med hjälp av steril pincett, överföra provet från behållaren för transport till en 100 mm petriskål innehållande 10 – 20 mL CMT.
- Använd locket på petriskål som en skärande yta för att dissekera vävnad. Hålla vävnad försiktigt med pincett, separata slemhinnan av ectocervix eller livmoderhalskanalens från undersidan stromaceller och muskelvävnad (submucosa) med en skalpell och bladet att erhålla remsor av slemhinna.
Obs: Medan du arbetar på en bit vävnad, det är viktigt att hålla resten av vävnaden nedsänkt i medium att undvika vävnad uttorkning. - Strimlat slemhinnan 2 mm bred, avlägsna och kassera så mycket submucosa som möjligt, lämnar endast en 2 mm tjock lager av vävnad. Klipp remsor i 2 mm tjocka block. Detta bör resultera i vävnad bladsticklingar ungefär 8 mm3.
Försiktighet: Hantering vassa verktyg att dissekera mänskliga prover ökar risken för skador och nedsmutsning. Operatören bör bära metall, mesh, skärbeständiga handskar som extra skydd. - Överföring vävnad bladsticklingar i en ny 100 mm petriskål innehållande 10 – 20 mL CMT att undvika vävnad uttorkning samtidigt fortsätter med dissektion. I slutet av dissektion, snurra på plattan för att Slumpa explant distribution.
- Med steril pincett, över bladsticklingar till sterila 1,5 mL koniska rör (maximalt 16 bladsticklingar per rör). Ta bort alla medium i röret med pipett.
- Tina den HIV-1 beredningen i ett vattenbad vid 37 ° C. Vid behov späd virus beståndet med CM. överföring av viruset till de rör som innehåller bladsticklingar. Kassera någon kvarstående virus beredning.
Obs: Virus beståndet bör spädas så att det valda inokulatet ingår i en volym av minst 0,5 mL (tabell 1). För att minska resultatet variabiliteten mellan oberoende experiment, ska den samma virus användas för en hela studien (Tabell för material). - Överföra rören i en thermo-shaker och inkubera i 2 h vid 37 ° C gunga vid 300 rpm. Vänd försiktigt rören några gånger varje 30 – 60 min.
Obs: För en effektiv infektion är det viktigt att använda den minsta tid som krävs mellan upptining HIV-1 utarbetande och överföring av rören till 37 ° C. - Fyll en 6-well platta med 3 – 4 mL per brunn sterila fosfat buffert saltlösning (PBS). På den av inkubering med HIV-1, kassera alla virus förberedelser i rör i en behållare med desinficerande lösning med pipett. Över bladsticklingar till 6-väl plattan som innehåller PBS med pincett.
- Tillåt de bladsticklingar vila i PBS för 1 min på RT och sedan tvätta dem genom att försiktigt pipettering up-and-down PBS i brunnen 2 - 3 gånger. Kassera PBS i en behållare med desinficerande lösning med pipett. Tillsätt 3-4 mL ny PBS till varje brunn. Upprepa två gånger för totalt tre tvättar. Kassera PBS precis innan du överför bladsticklingar till de svampar att undvika vävnad uttorkning.
Obs: Bladsticklingar livmoderhalsens slemhinna, och i synnerhet livmoderhalskanalens, frigöra stora mängder slem under infektion. Det är viktigt att tvätta och ta bort så mycket slem som möjligt eftersom ospecifikt lagring på bladsticklingar och påföljande frisättning av virus i kultur supernatanten kan maskera virusreplikation. - Använda pincett, överföra 5-8 bladsticklingar ovanpå varje gelatinsvamp i en 12-bra platta. Tillbaka plattan till inkubatorn.
- Kassera alla biologiskt avfall i träffande behållare enligt institutets föreskrifter om hantering av farliga biologicals och särskilda riskbedömningen.
5. Histoculture
- Ändra CM varje 3 dagar från tidpunkten för infektion tills dag 12 – 15 efter infektion. Den CM eller bladsticklingar kan provtas med jämna mellanrum under hela kultur att bedöma HIV-1 replikering, bland andra parametrar.
- Sätta CM i vattenbad pre värmas vid 37 ° C.
Obs: Det krävs inte att komplettera CM med antibiotika lösning i detta skede. - Samla in ett urval av CM med en pipett och överför det till sterila 1,5 eller 2 mL skruvlock rör för lagring vid-80 ° C.
Obs: CM från replikera wells sammanförs på collection. - Skörda de vävnad bladsticklingar med steril pincett, ta bort det överflödiga medlet på bladsticklingar genom att placera dem på ett papper (tillval) och överför bladsticklingar till sterila 1,5 eller 2 mL skruvlock rör. Bearbeta eller lagra vävnadsproverna som krävs av experimentet.
Obs: För flödescytometri rötas omedelbart bladsticklingar med en enzymatisk cocktail till en enskild cell suspension (för mer detaljer se referenser 1, 9, 16 och 17). För RNA-extraktion hålls bladsticklingar i en RNA stabilisering lösning vid 4 ° C över natten innan du förvarar dem vid-80 ° C. För DNA-extraktion eller i situ färgning (livmoderhals), kan bladsticklingar snapin-frysta i flytande kväve eller torris/etanol flytgödsel och lagras vid-80 ° C. Alternativt kan tonsillar bladsticklingar fastställas genom nedsänkning i en lösning av PBS och 4% PARAFORMALDEHYD för i situ färgning. - Sug ut den kvarvarande CM i brunnen med en pipett och kasta den i en behållare med desinficerande lösning. Luta plattan och tryck försiktigt Gelatinsvampar till den övre delen av brunnen för att tillåta medellång till samlas på botten, och sedan aspirera och kasta den.
- Tillsätt 3-4 mL CM till varje brunn. Med hjälp av steril pincett, returnera någon vävnad explants som tappade i medellång till gelatinsvampen. Tillbaka plattan till inkubatorn.
- I slutet av kultur, kassera alla biologiskt avfall i träffande behållare enligt institutets föreskrifter om hantering av farliga biologicals och särskilda riskbedömningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flera tekniker kan användas för att bedöma HIV-1 replikering i vävnad bladsticklingar. Våra standard avläsning är att mäta mängden HIV-1 p24gag släpptes i CM över tid med en immunoassay18.
Vävnaden bladsticklingar från olika givare, infekterade med det samma inokulatet av samma bestånd, HIV-1, kan ge olika mängder virus (tabell 1). Detta beror på flera faktorer, exempelvis antalet och status av målceller för HIV-1 och förekomst av samtidig infekterar patogener i vävnad16,19. I figur 1ger vi ett exempel på produktiva och misslyckade HIV-1 infektion i livmoderhalsens slemhinna bladsticklingar som definieras av mängden p24gag släppt i CM jämfört med givare-matchade bladsticklingar behandlas med den antiretrovirala läkemedel lamivudin (3TC) som dämpar helt HIV-1-replikering. Även om den här kontrollen visas överflödiga för infektion av vävnad bladsticklingar från givaren i A, hjälper det att diskriminera misslyckade b från produktiv infektion (C) i bladsticklingar som ger låga nivåer av HIV-1-replikering.
Användningen av en antiretroviral drog som en okontrollerad situation kan vara användbart att studera HIV-1 infekterade vävnader som hamnen lågt antal målceller, liksom slemhinnan i livmoderhalsen och när du använder långsam-replikering av HIV-1-varianter, såsom vissa primära isolat. Dessutom för vävnader infekterade med sådana virus, är det viktigt att överväga att använda mer känsliga detektionsmetoder, exempelvis qPCR.
Figur 1 : HIV-1 replikering i livmoderhalsens slemhinna explants från tre olika vävnad givare. Cervikal vävnad bladsticklingar var infekterade med det samma inokulatet av HIV-1BaL genom nedsänkning i virus lager och odlade i 15 dagar i närvaron eller frånvaron av den antiretrovirala läkemedel lamivudin (3TC) koncentration 10 µM. odlingsmedium samplades varje 3 dagar och prover från replikera wells var poolade på samling för analys av HIV-1 replikering av HIV-1 p24gag immunoassay. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Vävnadstyp | Virus | Inokulum per explant (pg av HIV-1 p24gag) | Lol av bladsticklingar | Odlingsmedium volym (mL) | Lol brunnar (tekniska replikat) | HIV-1 p24gag produktion (ng/mL) |
| Tonsillar | HIV-1BaL | 350 – 500 | 9 | 3-4 | 2 – 3 | 1 – 10 |
| HIV-1LAI.04 | 9 | 3-4 | 2 – 3 | 1 – 100 | ||
| Livmoderhalscancer | HIV-1BaL | 1 500 – 2 000 | 8 | 1 | 2 | 1 – 5 |
| HIV-1LAI.04 | 8 | 1 | 2 | Omätbara |
Tabell 1: referensvärden för HIV-1 inokulum för infektion av vävnad bladsticklingar och virus produktion. Värdet av HIV-1 inokulatet per enskilda vävnad explant refererar till viruslagren koncentration 50 – 70 ng/mL: en volym av 7 µL av outspädd virus lager används för att infektera varje tonsillar explant ovanpå en gelatinsvamp; en volym av 500 µL av outspädd virus lager används för att infektera 16 cervikal bladsticklingar genom nedsänkning i en 1,5 mL tub. Cervikal bladsticklingar tvättas i stor utsträckning i PBS innan du överför dem till Gelatinsvampar. Värdet av HIV-1 produktion av vävnad bladsticklingar refererar till det sammanlagda beloppet av p24gag utgivet 8 bladsticklingar i 1 mL (livmoderhals) eller 9 bladsticklingar i 3-4 mL (tonsillerna) odlingsmedium (CM) provtas varje 3 dagar över 12-15 dagar av kultur. CM från replikera brunnar är poolade på samlingen för varje tidpunkt innan du ersätter den med färska CM. Värdet av p24gag koncentration mätt på dag 3 uteslöts från analysen eftersom det delvis står för virus absorption på bladsticklingar och efterföljande övergång till CM, dvs, inokulum överföring. Infektion av cervikal vävnad med HIV-1LAI.04 leder vanligtvis inte till detekterbart HIV-1 replikering i våra experimentella system16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Användning av mänsklig vävnad explants för studier av HIV-1 infektion ger fördelar jämfört med traditionella bi-dimensionell och monotypiskt experimentella system, såsom primära celler eller cellinjer, på grund av sin överlägsna förmåga att återge intercellulära interaktioner och cellulära funktioner (t.ex., cytokin produktion) som de är i vivo. Dock tonsillar och cervikal vävnad skiljer sig i många aspekter, inklusive numret och fenotypiska och funktionella egenskaper HIV mål celler1,16. Av samma skäl utför HIV-1-varianter med olika samtidig receptor tropism (t.ex., CCR5-tropism HIV-1BaL vs. CXCR4-tropism HIV-1LAI.04) annorlunda både i tonsiller och livmoderhalsen (tabell 1). Fördelningen av HIV coreceptors på målceller vid immun induktiva och effektor webbplatser endast delvis konton för lokala infektionskänslighet: CD4 T-celler som bär CXCR4 är rikligare än CCR5-uttryckande celler i tonsillar vävnad, således förklara högre replikering nivåer av HIV-1LAI.04 än HIV-1BaL, men receptorerna är lika representerade i livmoderhalsens slemhinna16. Ändå, vi sällan upptäcks produktiva virusreplikation i cervikal vävnad utmanas med HIV-1LAI.04, vilket är i linje med förmånliga överföring av individuella HIV-1 CCR5-tropism varianter observerats i vivo20 . Detta tyder på att differentiering och aktiveringen status av målceller för HIV-1 i slutändan kan fastställa deras förmåga att stödja HIV-1 replikering16.
Gelatinsvampar är hemostatiska anordningar erhålls från renat svin hud (kollagen), som är utformade för att vara helt uppslukad av den mänskliga kroppen efter några veckor. Vi rekommenderar att du använder produkter som visar långsam nedbrytningshastigheten i kultur som de bättre passar syftet att upprätthålla vävnad bladsticklingar på gränssnittet vätska-luft för 2-3 veckor. Vi rekommenderar också testa olika partier av samma produkt att bedöma konsekvent prestanda i explant kultur.
På samma sätt, typ och massa fetalt bovint serum (FBS) kan påverka HIV-1 replikering nivåer. Vi rekommenderar testning flera partier av FBS för CM optimering och använda den samma massa FBS för en hela studien. Vi rutinmässigt testa FBS på vävnad bladsticklingar från 10 givare och välj det parti som ger den högsta HIV-1-replikeringen.
För de flesta av experiment pool vi bladsticklingar från livmoderhalskanalens och ectocervix att maximera antalet experimentella villkor. Man kan överväga att hålla dem åtskilda på grund av deras olika strukturella och immunologiska funktioner21. Även endocervikala explants release och fortsätta att producera en stor mängd slem i kultur som kan störa efterföljande analys. Ser som det område som omfattas av livmoderhalskanalens är mycket mindre än ectocervix, det är utmanande att genomföra HIV infektion experiment uteslutande på endocervikala slemhinnan replikerar med hjälp av ett adekvat antal bladsticklingar och tekniska.
Utföra HIV-1 infektion genom nedsänkning av livmoderhalscancer bladsticklingar maximerar chanserna att få en produktiv infektion på grund av det lägre antalet CD4 T-celler finns i slemhinnan jämfört med lymfoid vävnad. Av samma anledning, cervikal vävnad är mer känsliga för övernattning lagring och ger högre HIV-1 replikering när infekterade strax efter kirurgi och omedelbart efter dissektion. Även om infektion genom nedsänkning i virus lager kan utföras även för tonsillar vävnad att säkerställa enhetlig exponering av bladsticklingar till virus, medför detta tillvägagångssätt högre vävnad manipulation och cell förlust än infektion av bladsticklingar på Gelatinsvampar som beskrivs i protokollet.
Polariserade system av HIV-1 utmaning kultur av slemhinnor vävnader finns och används för närvarande i andra laboratorier3,22,23,24,25. Även om dessa system är en värdefull modell av HIV-1 intrade och penetration i slemhinnan, deras Ställ är generellt mer tidskrävande och kräva omfattande vävnad manipulation. Icke-polariserat modeller av slemhinnor överföring/patogenes erbjuder fortfarande en giltig plattform för att utreda regleringen av HIV-1-replikering och den lokala poolen av HIV-infekterade celler av endogena och exogena faktorer9,17 , 26, inklusive droger12,13,14,15.
Mellan givarens variabilitet kan representera en huvudfråga för resultatet reproducerbarhet mellan oberoende experiment som utförs med hjälp av prover från flera givare. Variabilitet i cellulära sammansättningen kan också påverka områden inom samma prov, dvs, intra-givare variabilitet. Till reducera variabilitet och korrekt tolka resultat, är det viktigt att ställa in alla villkor inom ett experiment med hjälp av ett tillräckligt antal bladsticklingar erhållits från samma givare (givare-matchade villkorar). Resultaten kan normaliseras till intern kontroll när sammanställa data från flera experiment för statistisk analys. För att minska intra-givare variabilitet, rekommenderar vi inklusive minst 2 tekniska replikat för varje experimentella villkor, för sammanlagt 18 bladsticklingar tonsillar vävnad (9 per brunn) och 10-16 bladsticklingar av livmoderhalsens slemhinna (5-8 per brunn) (tabell 1). Tillgången till medicinska journaler och införandet av ytterligare analys av patientmaterial och/eller experimentella förhållanden, till exempel till adress inflammatoriska status av ett provexemplar kan avsevärt förbättra resultatet tolkning (se hänvisning 9 för ett exempel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av bidrag från den stiftelsen Blanceflor Boncompagni-Ludovisi nee Bildt (http://blanceflor.se/), Stiftelsen Svenska läkare mot AIDS (http://www.aidsfond.se/, ref. FOa2014-0006), och Fondazione Andrea e Libi Lorini (http : / / fondazionelorini.it/) till Andrea Introini.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelfoam 12-7 mm Absorbable gelatin sponge | Pfizer | NDC: 0009-0315-08 | Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue. |
| SPONGOSTAN Standard 70 × 50 × 10 mm Absorbable haemostatic gelatin sponge | Ferrosan Medical Devices | MS0002 | Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue. |
| RPMI 1640 with phenol red and glutamine | ThermoFisher Scientific | 21875034 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Modified Eagle's medium (MEM) non-essential aminoacids (100x) | ThermoFisher Scientific | 11140035 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Sodium pyruvate, 100 mM (100x) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Gentamicin 50 mg/mL (1000x) | ThermoFisher Scientific | 15750037 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Amphotericin B 250 μg/mL (100x) | ThermoFisher Scientific | 15290018 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Fetal bovine serum (FBS) | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). | ||
| Ticarcillin disodium salt | Sigma-Aldrich | T5639-1G | Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3 g) and potassium clavulanate (100 mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT. |
| Potassium clavulanate | Sigma-Aldrich | 33454-100MG | Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3 g) and potassium clavulanate (100 mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT. |
| Sterile phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 w/o calcium, magnesium and phenol red | To use for storage and transportation of surgical specimens. PBS can be replaced with another isotonic solution with physiologic pH. Culture medium is best for overnight storage. | ||
| Sterile cell culture grade water | |||
| Sterile transportation container | |||
| 70% ethanol solution | |||
| Disinfectant solution for biological waste disposal | |||
| Sterile metal forceps or tweezers | |||
| Sterile metal scissors | |||
| Sterile flat weighing metal spatula | |||
| Sterile scalpels and blades | |||
| 6-well cell culture plates | |||
| 12-well cell culture plates | |||
| Sterile Petri dish, 100 mm × 20 mm | |||
| Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1BaL | NIH AIDS Reagent Program | 510 | The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1LAI.04 | NIH AIDS Reagent Program | 2522 | The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Lamivudine (3TC) | NIH AIDS Reagent Program | 8146 | Resuspend in DMSO at 10 mg/mL, aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Biological safety cabinet | |||
| Water-jacketed CO2 incubator, set at 37 °C, 5% CO2, ≥ 90% humidity | |||
| Water bath set at 37 °C | |||
| Sterile 1.5 and 2mL screw cap tubes | |||
| Dry bath shaker with heating block for 1.5 mL tubes, set at 37 °C, 300 rpm |
References
- Grivel, J. C., Margolis, L. Use of human tissue explants to study human infectious agents. Nature protoc. 4 (2), 256-269 (2009).
- Glushakova, S., Grivel, J. C., Fitzgerald, W., Sylwester, A., Zimmerberg, J., Margolis, L. B. Evidence for the HIV-1 phenotype switch as a causal factor in acquired immunodeficiency. Nat Med. 4 (2), 346-349 (1998).
- Dezzutti, C. S. Animal and human mucosal tissue models to study HIV biomedical interventions: can we predict success. J Int AIDS Soc. 18 (1), 20301 (2015).
- Global epidemic Update 2016. UNAIDS. , Available from: http://www.unaids.org/en/resources/documents/2016/Global-AIDS-update-2016 (2016).
- Lederman, M. M., Margolis, L. The lymph node in HIV pathogenesis. Semin Immunol. 20 (3), 187-195 (2008).
- Chun, T. W., Moir, S., Fauci, A. S. HIV reservoirs as obstacles and opportunities for an HIV cure. Nat Immunol. 16 (6), 584-589 (2015).
- Biancotto, A., et al. HIV-1 induced activation of CD4+ T cells creates new targets for HIV-1 infection in human lymphoid tissue ex vivo. Blood. 111 (2), 699-704 (2008).
- Van Laar, J. M., et al. Sustained secretion of immunoglobulin by long-lived human tonsil plasma cells. Am J Pathol. 171 (3), 917-927 (2007).
- Introini, A., et al. Seminal plasma induces inflammation and enhances HIV-1 replication in human cervical tissue explants. PLoS Pathog. 13 (5), 1006402 (2017).
- Grivel, J. C., et al. Suppression of CCR5- but not CXCR4-tropic HIV-1 in lymphoid tissue by human herpesvirus 6. Nat Med. 7 (11), 1232-1235 (2001).
- Rollenhagen, C., Lathrop, M. J., Macura, S. L., Doncel, G. F., Asin, S. N. Herpes simplex virus type-2 stimulates HIV-1 replication in cervical tissues: implications for HIV-1 transmission and efficacy of anti-HIV-1 microbicides. Mucosal Immunol. 7 (5), 1165-1174 (2014).
- Lisco, A., et al. Acyclovir is activated into a HIV-1 reverse transcriptase inhibitor in herpesvirus-infected human tissues. Cell Host Microbe. 4 (3), 260-270 (2008).
- Vanpouille, C., et al. A common anti-cytomegalovirus drug, ganciclovir, inhibits HIV-1 replication in human tissues ex vivo. AIDS. 31 (11), 1519-1528 (2017).
- Andrei, G., et al. Topical tenofovir, a microbicide effective against HIV, inhibits herpes simplex virus-2 replication. Cell Host Microbe. 10 (4), 379-389 (2011).
- Greenhead, P., Hayes, P., Watts, P. S., Laing, K. G., Griffin, G. E., Shattock, R. J. Parameters of human immunodeficiency virus infection of human cervical tissue and inhibition by vaginal virucides. J Virol. 74 (12), 5577-5586 (2012).
- Saba, E., et al. HIV-1 sexual transmission: early events of HIV-1 infection of human cervico-vaginal tissue in an optimized ex vivo model. Mucosal Immunol. 3 (3), 280-290 (2010).
- Introini, A., Vanpouille, C., Lisco, A., Grivel, J. C., Margolis, L. Interleukin-7 facilitates HIV-1 transmission to cervico-vaginal tissue ex vivo. PLoS Pathog. 9 (2), 1003148 (2013).
- Biancotto, A., et al. A highly sensitive and dynamic immunofluorescent cytometric bead assay for the detection of HIV-1 p24. J Virol Methods. 157 (1), 98-101 (2009).
- Lisco, A., Vanpouille, C., Margolis, L. War and peace between microbes: HIV-1 interactions with coinfecting viruses. Cell Host Microbe. 6 (5), 403-408 (2009).
- Keele, B. F., et al. Identification and characterization of transmitted and early founder virus envelopes in primary HIV-1 infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (21), 7552-7557 (2008).
- Pudney, J., Quayle, A. J., Anderson, D. J. Immunological microenvironments in the human vagina and cervix: mediators of cellular immunity are concentrated in the cervical transformation zone. Biol Reprod. 73 (6), 1253-1263 (2005).
- Ganor, Y., et al. Within 1h, HIV-1 uses viral synapses to enter efficiently the inner, but not outer, foreskin mucosa and engages Langerhans-T cell conjugates. Mucosal Immunol. 3 (5), 506-522 (2010).
- Cavarelli, M., Foglieni, C., Rescigno, M., Scarlatti, G. R5 HIV-1 envelope attracts dendritic cells to cross the human intestinal epithelium and sample luminal virions via engagement of the CCR5. EMBO Mol Med. 5 (5), 776-794 (2013).
- Cummins, J. E., et al. Preclinical testing of candidate topical microbicides for anti-human immunodeficiency virus type 1 activity and tissue toxicity in a human cervical explant culture. Antimicrob Agents Chemother. 51 (5), 1770-1779 (2007).
- Abner, S. R., et al. A human colorectal explant culture to evaluate topical microbicides for the prevention of HIV infection. J Infect Dis. 192 (9), 1545-1556 (2005).
- Saba, E., et al. Productive HIV-1 infection of human cervical tissue ex vivo is associated with the secretory phase of the menstrual cycle. Mucosal Immunol. 6 (6), 1081-1090 (2013).
