Musen fedtvæv indsamling og forarbejdning til RNA analyser
Summary
Formålet med dette oplæg er at præsentere en trinvis procedure til at indsamle forskellige hvide fedtvæv fra mus, behandle de fedt prøver og udtrække RNA.
Abstract
I forhold til andre væv, har hvidt fedtvæv en betydeligt mindre RNA og protein indhold til downstream applikationer såsom real-time PCR og Western Blot, da det for det meste indeholder lipider. RNA isolering fra fedtvæv prøver også udfordrende som ekstra trin er nødvendige for at undgå disse lipider. Vi præsenterer her, en procedure for at indsamle tre anatomisk anderledes hvidt fedtvæv fra mus, til at behandle disse prøver og udføre RNA isolering. Vi yderligere at beskrive syntesen af cDNA og gen expression eksperimenter ved hjælp af real-time PCR. Den hermed beskrevne protokol giver mulighed for reduktion af forurening fra dyrets hår og blod på fedtpuder samt krydskontaminering mellem forskellige fedtpuder under væv samling. Det er også blevet optimeret til at sikre tilstrækkelig kvantitet og kvalitet af RNA ekstraheret. Denne protokol kan i vid udstrækning anvendes til enhver musemodel, hvor fedtvæv prøver er nødvendige for rutinemæssig eksperimenter såsom real-time PCR men er ikke beregnet til isolation fra primære adipocytter cellekultur.
Introduction
Fedme er en verdensomspændende epidemi, som kan føre til komplikationer såsom type 2-diabetes1. Kost-induceret fede og genetisk modificerede animalske modeller er ofte anvendes til forskning i fedme og dens tilknyttede komplikationer. Traditionelt hvidt fedtvæv er kendt som et opbevaringsrum til overskydende energi og er for det meste består af lipider, mens brunt fedtvæv omdanner energi til varme2,3. Fedtvæv vil er dynamisk og udvide og krympe afhængig af mange faktorer såsom fødeindtagelse og fysisk aktivitet. Derfor, bestem medvirkende faktorer til disse ændringer ved passende fedtvæv indsamling og håndtering er påkrævet4.
Blandt hvide fedtvæv, er det generelt accepteret, at subkutan og visceralt fedt depoter har forskellige egenskaber såsom anatomiske lokalisering og fungere2,5. Derfor, for at undgå modstridende resultater eller store forskelle i cadmiumkoncentrationerne, opmærksomhed skal træffes for at undgå krydskontaminering mellem disse forskellige fedt depoter når indsamling fedtpuder.
Desuden er der tre store udfordringer, når isolering af RNA og protein fra mus hvidt fedtvæv. Første er indsamling fedtpuder i overvægtige mus ikke en let opgave, som den grænse, der adskiller forskellige hvide fedt depoter ikke er altid klart, i modsætning til andre organer som nyrer og hjerte6. For det andet på grund af den høje lipid indhold af fedtvæv under RNA eller protein isolation, et lag af lipider flyder ovenpå og forhindrer direkte adgang til prøven. Tredje, i modsætning til brunt fedtvæv eller andre væv, hvidt fedtvæv har betydeligt lavere RNA og protein indhold og det er af største bekymring, når du bruger unge mus, mus fodret med en normal (N) kost og mus, som forventes at have lav fedt masserne (dvs. KO modeller, behandling med lægemidler, motion uddannelse, osv.) 7 , 8.
Derfor, at vælge den passende metode til at isolere RNA fra fedtvæv er kritisk. Alternative metoder til fenol/chloroform udvinding er kommercielle kits. De er typisk baseret på en indledende phenol ekstraktionstrinet, efterfulgt af RNA oprensning på en kolonne9. Disse kits er typisk dyrere og give prøver af lavere udbytte, mens RNA kvalitet kan være variabel men er mindre tidskrævende. Men en af de største fordele til phenol løsning/chloroform udvinding beskrevet her er muligheden for isolering af RNA, DNA og protein fra en enkelt prøve10. Da mus fedtpuder er som regel små og give lille mængde af RNA og proteiner (især i lean musemodeller), maksimere disse protokoller den data, man kan få ud af et lille udsnit.
Formålet med dette papir er at beskrive i detaljer en metode til at sikre passende stikprøve samling fra tre mus hvidt fedtvæv depoter samt mængden og kvaliteten af RNA isolering. RNA opnås ved at følge denne protokol kan bruges til at udføre real-time PCR assays. Denne protokol er ikke beregnet til RNA isolering fra kulturperler primære adipocytter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Følgende HF-kost fodring, blev overvægtige mus fundet at være steget krop og hvidt fedtvæv vægte sammenlignet med mus fodret en N kost. RNA udvundet ved hjælp af phenol løsning givet prøver med god renhed. Leptin er et adipokine primært fremstillet af fedtvæv og er kendt for at korrelere positivt med fedt masse16. Som forventet, øget leptin mRNA udtryk i overvægtige mus i bankkonsortiet med deres fedtmasse.
Denne metode har flere kritiske trin. Den store er …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Diabetes Canada.
Materials
| 1 mL seringes | |||
| 1X TE solution (10 mM Tris-HCl and 1 mM EDTA•Na2. pH 8.0) | |||
| 22 G needles | |||
| 26 G needles | |||
| 75% Ethanol | |||
| Block heater (dry bath) | |||
| Chloroform | Sigma | C2432-500mL | |
| dATP | Thermo scientific | R0141 | |
| dCTP | Thermo scientific | R0151 | |
| dGTP | Thermo scientific | R0161 | |
| DNase I (1 U/µl) | Thermo scientific | EN0521 | |
| dTTP | Thermo scientific | R0171 | |
| Faststart Universal SYBR green Master (Rox) | Roche | 4913922001 | |
| Faststart universal SYBR green master (Rox) fluorescent dye | Roche | 4913914001 | |
| Filtered tips | |||
| Forceps | Instrumentarium | HB275 | |
| Gauze | |||
| Hammer | |||
| High fat rodent diet | Bio-Serv, Frenchtown, NJ | F3282 | |
| Isopropanol | Laboratoire MAT | IH-0101 | |
| Leptin forward PCR primer (5’-GGGCTTCACCCCATTCTGA-3’) 10 uM | |||
| Leptin reverse PCR primer (5’-GGCTATCTGCAGCACATTTTG-3’) 10 uM | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Maxima Reverse Transcriptase (enzyme and 5x buffer) | Thermo scientific | EP0742 | |
| Nanopure water (referred as ultrapure water) | |||
| Nitrile examination gloves | |||
| Nitrile gloves | |||
| Normal rodent diet | Harlan Laboratories, Madison, WI | Harlan 2018 | |
| P1000 pipetman | |||
| P2 pipetman | |||
| P20 pipetman | |||
| P200 pipetman | |||
| Phenol solution (TRIzol) | Ambion Life Technologies | 15598018 | |
| Pre-identified aluminium foil | |||
| Quartz spectrophotometer cuvette | |||
| Rack for PCR tube strips | |||
| Racks for RT-PCR tube strips | |||
| Random hexamers | Invitrogen | 58875 | |
| Real-time PCR Rotor Gene system | Corbett research | RG-3000 Rotor-Gene thermal cycler | |
| Refrigerated bench-top centrifuge | |||
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo scientific | EO0381 | |
| RNase-free 1.5 mL eppendorf tubes | |||
| RNase-free 1.5 mL screw cap tubes | |||
| RNase-free PCR tube strips (0.2 mL) and caps | |||
| RNase-free water | Hyclone | SH30538.02 | |
| RT-PCR machine | Qiagen | Rotor-Gene Corbett 3000 | |
| RT-PCR tube strips (0.1 mL) and caps | |||
| S16 forward PCR primer (5’-ATCTCAAAGGCCCTGGTAGC-3’) 10 uM | |||
| S16 reverse PCR primer (5’ ACAAAGGTAAACCCCGATCG-3’) 10 uM | |||
| Spectrophotometer | Biochrom | Ultrospec 3100 pro | |
| Stainless steel mortar and pestle | |||
| Surgical pads | Home made a foam board wrapped in a disposable absorbent underpad | ||
| Surgical scissors | Intrumentarium | 130.450.11 | |
| Thermal cycler | |||
| Thermal cycler | Biometra | Thermocycler | |
| Vortex mixer | |||
| Weighing spatula |
References
- Guh, D. P., et al. The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: a systematic review and meta-analysis. BMC. Public Health. 9, 88 (2009).
- Wronska, A., Kmiec, Z. Structural and biochemical characteristics of various white adipose tissue depots. Acta Physiol (Oxf). 205 (2), 194-208 (2012).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).
- Holland, N. T., Smith, M. T., Eskenazi, B., Bastaki, M. Biological sample collection and processing for molecular epidemiological studies. Mutat Res. 543 (3), 217-234 (2003).
- Ibrahim, M. M. Subcutaneous and visceral adipose tissue: structural and functional differences. Obes Rev. 11 (1), 11-18 (2010).
- Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, identification, and excision of murine adipose depots. J Vis Exp. (94), (2014).
- Hemmrich, K., Denecke, B., Paul, N. E., Hoffmeister, D., Pallua, N. RNA Isolation from Adipose Tissue: An Optimized Procedure for High RNA Yield and Integrity. Laboratory Medicine. 41 (2), 104-106 (2010).
- Cirera, S. Highly efficient method for isolation of total RNA from adipose tissue. BMC Res Notes. 6, 472 (2013).
- Tan, S. C., Yiap, B. C. DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present. J Biomed Biotechnol. 2009, 574398 (2009).
- Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples. BMC Biotechnol. 14, 94 (2014).
- Tan, P., et al. Impact of the prorenin/renin receptor on the development of obesity and associated cardiometabolic risk factors. Obesity (Silver. Spring). 22 (10), 2201-2209 (2014).
- Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines. Methods. 50 (4), 1-5 (2010).
- Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. L. Bleach gel: a simple agarose gel for analyzing RNA quality. Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).
- Mercure, C., Prescott, G., Lacombe, M. J., Silversides, D. W., Reudelhuber, T. L. Chronic increases in circulating prorenin are not associated with renal or cardiac pathologies. Hypertension. 53 (6), 1062-1069 (2009).
- Dusaulcy, R., et al. Adipose-specific disruption of autotaxin enhances nutritional fattening and reduces plasma lysophosphatidic acid. J. Lipid Res. 52 (6), 1247-1255 (2011).
- Nakamura, K., Fuster, J. J., Walsh, K. Adipokines: a link between obesity and cardiovascular disease. J Cardiol. 63 (4), 250-259 (2014).
- Taylor, S. C., Mrkusich, E. M. The state of RT-quantitative PCR: firsthand observations of implementation of minimum information for the publication of quantitative real-time PCR experiments (MIQE). J Mol Microbiol Biotechnol. 24 (1), 46-52 (2014).
- Hummon, A. B., Lim, S. R., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Isolation and solubilization of proteins after TRIzol extraction of RNA and DNA from patient material following prolonged storage. Biotechniques. 42 (4), 467-470 (2007).
