Summary
本稿の目的は、マウスから異なる白色脂肪組織を収集、脂肪質のサンプルを処理および RNA を抽出する手順を提示することです。
Abstract
他の組織と比較して、白色脂肪組織は、脂質がほとんど含まれているのでは、下流用リアルタイム PCR および西部のしみなどかなり少ない RNA および蛋白質内容です。これらの脂質を避けるために余分な手順が必要と脂肪組織サンプルからの RNA の隔離も挑戦します。これらのサンプルを処理し、RNA の隔離を実行するマウスから 3 つの異なる解剖学的白色脂肪組織を集めるための手順を紹介します。さらにリアルタイム PCR を用いた cDNA や遺伝子発現実験の合成について述べる。ここに記載されているプロトコルには、動物の毛や組織コレクション中に別の脂肪パッド間の交差汚染と同様、脂肪パッド上の血からの汚染の削減ができます。また、抽出した RNA の十分な量と質を確保するため最適化されています。このプロトコル脂肪組織サンプル、リアルタイム PCR など日常の実験に必要な任意のマウスのモデルに広く応用することができますが、主な脂肪細胞培養からの分離のためのものではありません。
Introduction
肥満はタイプ 2 の糖尿病1などの合併症につながることが世界的に流行です。食餌誘導性肥満と遺伝子組み換え動物モデルは、肥満とその関連する合併症で研究に頻繁に使用されます。通常、白色脂肪組織は余分なエネルギーのための収納スペースとして知られている、脂質の構成は主にエネルギーに変える褐色脂肪組織熱2,3間。脂肪組織は動的と拡大し、食品の摂取量、身体活動など多くの要因によって縮小します。したがって、これらの変更に貢献の要因を決定する適切な脂肪組織の採取と処理が必要な4 です。
白色脂肪組織の間で、皮下脂肪および内臓脂肪質のターミナルを解剖学的局在など異なるプロパティを持つ機能2、5それを一般に認められます。その結果、矛盾する結果や大規模な変動を避けるためには、注意を脂肪パッドを収集するときこれらの異なる脂肪質のターミナル間の交差汚染を避けるために取られる必要があります。
また、白いマウス脂肪組織からタンパク質や RNA を隔離するときの 3 つの主要な課題があります。まず、肥満マウスの脂肪パッドを収集別の白い脂肪質のターミナルを隔てる境界線は常に明確で心6腎臓など他の臓器とは対照的ではない、簡単な作業ではありません。第二に、RNA または蛋白質の分離の間に、脂肪の高い脂質含量のため、脂質の層の上に浮かぶし、サンプルに直接アクセスできなくなります。第三に、褐色脂肪組織や他の組織ではなく白色脂肪組織は RNA および蛋白質含量がかなり低いとこれは若いマウスを使用する場合の大きな懸念材料は、投与されたマウスは通常の (N) 食事あり、マウスが期待される低脂肪塊 (すなわちKO モデル、薬物による治療は運動トレーニングなど)。7,8。
したがって、脂肪組織からの RNA を隔離する適切な方法を選択することは重要です。フェノール/クロロホルム抽出する別の方法は、商業キットです。彼らは通常列9の RNA の浄化に続いて、初期のフェノール抽出手順に基づいています。しかし、これらのキット通常より高価なと RNA の品質は、変数かもしれない低い収率のサンプルを与えるより時間がかかる。ただし、フェノールのソリューション/クロロホルム抽出ここで説明する最も大きな利点の 1 つは単一のサンプル10からの蛋白質、DNA、RNA を分離する可能性です。マウス脂肪パッドは、通常小さい (無駄のないマウス モデル) を中心に少量の RNA および蛋白質を与えるので、これらのプロトコルは、小さなサンプル 1 つ得ることができるデータを最大化します。
本稿の目的は、白い 3 つのマウス脂肪組織拠点と同様の RNA の隔離の質と量から適切なサンプル収集を確保する方法を詳しく説明するようです。このプロトコルに従うことによって得られる RNA は、リアルタイム PCR の試金を実行する使用できます。このプロトコルは培養された主な脂肪細胞からの RNA の隔離のためのものではありません。
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Protocol
ケアの手順で使用するマウスの管理と動物保護のためのカナダの理事会によって設定実験動物の使用のための基準を遵守しました。すべてのプロシージャは、大学動物ケアとなかよし研究所利用委員会によって承認されました。
1. 剖検と男性マウス脂肪組織コレクション
- 研究目的に応じて実験グループを作る。本研究では採取した雄マウスの 2 つのグループから C57Bl/6 背景に (n = 12-14/グループ)。確認ここで使用されるマウス 12-15 週齢と normal (N) または (HF) の高脂肪食にアクセス 12 h 明暗サイクルに保持されている期間 10 週間11自由を水します。
- それが 10 分間 6% CO2にさらされている密閉されたチャンバー内でマウスを配置することによって、マウスを安楽死させます。
- 動物の胸骨の左側にちょうど 26 G 1/2po 針搭載 1 mL 注射器をゆっくりと挿入して動物の血液の大部分を除去するピストンをゆっくりと引いて心臓穿刺を行います。注射器が動物の体に平行であることを確認します。血液が注射器に付属していない場合は、ピストンを引きながら注射器をゆっくりと回転させます。
注:(0.8 と 1 mL 血液量) の間成功心臓穿刺は、血と脂肪組織の汚染を減少します。 - その裏にマウスを置くし、図 1に示すように 22 G 針を使用してパッドの各足をピンします。
- ガーゼでこするアルコールでマウスの皮膚これにより、髪はフラットのまま、脂肪組織サンプルの髪汚染を削減として一方向運動を次によって性器まで首から始まって数回髪を離れず。
- きれいなない滅菌鉗子、手術用はさみを使用して、生殖器官の近くの中央の皮膚を昇格させるし、0.3 mm の小さな切開を行います。
- 水平方向に開いた穴にハサミを挿入し、腹壁から腹部の皮膚をデタッチします。
注:これは、皮膚と腹壁の間の空間に鈍的切離でないこの空間は、膜を切断することによって行われます。 - 鉗子を使用すると、開いた穴の付近中央の皮膚を昇格させるし、皮膚をカット オーバー、リネア アルバ胸郭 (マウスのサイズに応じて 〜 4 cm) 近くまで。
注:この空気に内臓脂肪を公開し、組織とその内容の整合性を変更するかもしれない脂肪質のパッドの乾燥につながるように腹部の筋肉を切断しないでください。 - 胸郭の真ん中から ~ 2 cm で右の腕に向かって皮膚をカットします。生殖器付近 ~ 2 cm 上右後肢の上の皮膚をカットします。
- 開かれた皮膚の一角を伸ばすし、22 G 針を使用してパッドの上それを突き止めます。他のコーナーを繰り返します。
注:皮膚にさらされる脂肪組織は、(SCF) (図 1A) 腹部の皮下脂肪です。 - 鈍的解剖と外科はさみ、肌にできるだけフラットに配置を使用して皮膚から切断、SCF を収集します。収集した後は、事前に特定したアルミ箔に SCF を置きます。
注:収集または汚染、皮膚や髪の脂肪組織を変更サンプル品質と RNases による RNA の収穫。あまり時間は脂肪組織を収集、サンプルがサンプルの質も変えることができる乾燥も。 - 動物の左側にある 1.9 に 1.11 を手順を繰り返します。アルミ箔で左と右の脂肪パッドをプール、液体窒素でサンプルを凍結します。
- 内臓脂肪組織にアクセスするには、クリーンですがない滅菌外科はさみとに沿って鉗子を使用して腹部の筋肉をカット、リネア アルバ、胸郭に性器からマウスのサイズに応じて、〜 4 cm に。マウスの腹部臓器の側へのアクセスを持っている ~2.5 cm 背中に向かって性器から腹部の筋肉に切開を行います。
- 生殖器の周りの脂肪はペリ-生殖腺の脂肪 (PGF) (図 1B)。精巣上体、精巣と精管に PGF をアタッチすると、デタッチ慎重にそれらの構造から左の脂肪パッド、事前に特定されたアルミ箔をつけます。右側を繰り返します。両方の PGFs が収集されると、液体窒素でサンプルを凍結します。
- 左側から開始して、右側に腹腔内から腸内を移動することによって、腎臓を公開します。腎臓を周囲の脂肪組織、腎周囲脂肪 (PRF) (図 1C)。PRF は、副腎 (図 1D) をまた囲みます。
- 分離し、PRF を収集する前に副腎を削除します。これは、脂肪組織よりちょうど少しピンカーは、退屈です。
注:腎臓は血液が脂肪組織を汚染し、この脂肪パッド内で副腎を識別することが難しく、この手順中に削除しないでください。 - 尿管、腎動脈、PRF と腎臓を体の残りの部分から分離する静脈を切断することによって終わる背中筋肉の壁から PRF を分離します。切断し腎被膜を取除くことによって腎臓から PRF を分離します。PRF は、カプセルに接続されたままです。
- 右側の 1.15 と 1.17 の手順を繰り返します。両方の PRF をアルミ箔に入れ、液体窒素でサンプルを凍結します。
- 収集するすべてのマウスでは 1.18 に 1.2 の手順から手順を繰り返します。
- 脂肪組織の研削を続行またはそれ以降の抽出の-80 ° C のフリーザーで試料を保存します。サンプルは、いくつかの年4の-80 ° C で安定して保存できます。
2. 地盤の造成白色脂肪組織の RNA の隔離
注:皮膚が RNases RNA の劣化を促進することが、分離後サンプルの質と RNA の収穫を変化させるなど、含まれている各ステップの手袋を着用します。
- 準備しマウス、白色脂肪組織の種類ごとに 1 つあたり RNase フリー 1.5 mL コニカル スクリュー キャップ チューブの 3 つを識別し、ラックの上に置きます。
注:肥満の動物は、彼らは脂肪の固まりを増加している追加のチューブを必要があります。これは特に、1 つのマウスの 7 管までの SCF に true が得られました。 - 70% エタノールでベンチをきれいにし、表面に清潔で新しいベンチ用紙を入れてください。
- 脂肪組織が新鮮なマウスから採取した、-80 ° C のフリーザーにあらかじめ格納されているかどうかは、プロシージャの初めまで 1 つの液体窒素で満たされた容器のすべてのサンプルを収集します。
- 液体窒素容器にそれらを置くことによって、乳鉢、乳棒、ヘラを凍結します。液体窒素は「沸騰」させる停止したら、脂肪組織研削を開始できます。
注:この手順では、モルタル、ヘラ、円錐管と脂肪組織は、全体のプロセス中に冷蔵滞在する必要があります。任意の熱が脂肪組織を溶かすし、RNA の抽出が困難になります。また、セラミックの乳鉢と乳棒を使用して、ドライアイスまたは液体窒素を使用して、寒さを維持 1 つ可能性があります。 - すべて RNase フリー 1.5 mL コニカル スクリュー キャップ チューブ ステップ 2.2 ドライアイス上でそれらを冷却する覚悟を配置します。
- 手に凍傷を避けるためには、茶色の紙のいくつかの層を使用して、液体窒素からモルタルを持ち上げ、作業ベンチの上に置きます。
- 液体窒素から脂肪組織サンプルを収集し、乳鉢に入れて鉗子を使用します。すぐにアルミホイルの包みを開ける、モルタルのセンターでサンプルをドロップします。
注:脂肪組織サンプルが大きすぎるという場合に肥満マウスと、親指を使ってアルミ箔で小さい部品サンプルを破るし、各部分を個別に粉砕します。 - 液体窒素から杵を持ち上げてモルタルに合う茶色の紙のいくつかの層を使用します。茶色の紙で杵を押しながら一度か二度、乳棒の上部にヒットするのにハンマーを使用します。回転動作サンプルを挽く微粉が得られるまでには、モルタルと乳棒を押し下げます。
注:この手順は、適切な RNA 分離を取得する重要です。確かに、大きなフラグメントの存在は RNA の隔離を妨げるし、収量を減らします。 - 微粉末を取得した後、杵を削除液体窒素からヘラを拾うし、対応する中古冷蔵 1.5 mL の円錐管にサンプルを転送する使用します。
注:サンプルの溶解を防ぐために液体窒素にヘラをディップします。また、サンプルが融解するを防ぐために常にドライアイスで円錐形の管を保ちます。地上約 2/3 容量 (〜 1 mL) のサンプルでいっぱい円錐管は十分な RNA の収穫の量必要です。 - 約 1 mL を充填、一度チューブを閉じてその他液体窒素で満たされた容器にそれをドロップします。
注:過剰なサンプルを別中古冷蔵 RNase フリー 1.5 mL の円錐管に入れてして後で使用できる-80 ° C のフリーザーに格納できます。 - きれいにモルタル、臼・杵・次の脂肪組織のサンプルへキャリー オーバーを避けるために茶色の紙でヘラ。杵とヘラを寒さに液体窒素に置いて戻します。でも、茶色の紙は、私たちは毎日の RNA の隔離の茶色の紙のたての開いたパックを使用ない RNase フリーで。
- 次のサンプル手順 2.4 に 2.11.
- すべてのサンプルを処理すると、RNA の隔離を開始または後で使用するため-80 ° C のフリーザーで試料を保存します。
注:チューブの破裂を防ぐために完全に液体窒素容器に水没 [サンプル ボックスを固定します。クール ボックスと聞かせてから過剰な窒素を削除十分な液体窒素の上に浮くボックスにサンプルを並べ替える、-80 ° C のフリーザーに入れてください。
3 地面脂肪組織から RNA の隔離
注意:フェノールの解決は皮膚に有害です。実験用の上着、手袋、安全メガネを着用し、化学のフードの下でプロシージャを実行します。手順のフローチャートを図 2に示します。
- 準備し RNase フリー 1.5 mL の円錐管の 2 つのセットを識別し、ラックに入れてください。
- 脂肪組織された新鮮な地上または-80 ° C のフリーザーで保存済み、かどうかは、室温で主に行われている手順の開始まで液体窒素で満たされた容器のすべてのサンプルを収集します。
- 液体窒素から地面脂肪組織サンプルを選択し、管ラックに入れて鉗子を使用します。チューブは、ティッシュの粉の約 100 mg に相当する粉末の 〜 1 mL を含める必要があります。
- チューブをゆっくりと開きます。
注:室温で閉じた管を残してまたは余りにすぐにチューブの蓋を開くは、窒素からの圧力がチューブから脱出する傾向があるサンプル損失または損傷する可能性があります。 - フェノール溶液 500 μ L をサンプルに追加 (フェノール溶液の比率を 1:2: ティッシュの粉)。
- 周辺管の最大速度約 5 で渦蓋 s のゆっくりと (チューブから出てくる空気の音が聞こえる) 窒素からの圧力を解放する管を慎重に開いています。
- 3.5、3.6 の手順を繰り返します。サンプルに追加された最終的なフェノールの解決の容積は 1 mL です。
- サンプルを完全に溶解するまで、手順 3.6.
注:チューブが破裂するを防ぐために進む前に、チューブからのすべての圧力を解放することが重要です。 - 次のサンプル手順 3.4 3.8 を繰り返しながら室温で放置サンプルを聞かせてください。
- すべてのサンプルが処理されると、簡単に最高速度で渦とすべての部屋の温度で 5 分間のサンプルをインキュベートします。
- 4 ° C で 12 000 x g で 10 分間遠心します。管を室温に戻します。
注:3 段階は図 2に示すように、現在、遠心分離後: 脂肪 (top)、RNA (中央)、ペレット (下)。 - 各サンプルでは、フィルター選択されたチップを使用して P1000 ピペットと対応する管の最初のセットにできるだけ多くの RNA (中間のピンク層) を転送します。サンプル間のヒントを変更します。
- 脂質 (トップ層) によって RNA (中間層) の混入を最小限にするには、チューブの側の近くの先端と上のフェーズを貫きます。RNA を調剤先端の外側にできる脂質の転送を防ぐために新しいチューブの側面に触れることがなく新しい円錐管に。
- 各サンプルに純粋なクロロホルム 200 μ L を加え、室温で 15 s. 孵化 10 分のインバージョンによる混ぜます。
- 4 ° C で 12000 × g で 15 分遠心し、チューブを室温にもたらします。
注:遠心分離後、3 段階がある: RNA (トップ), DNA (中央) が含まれている中間期および蛋白質 (下) を含む赤のフェノール クロロホルム。 - 各サンプルでは、転送くらい透明な RNA を含む水相 (トップ期) としてできるだけ対応する円錐管の 2 番目のセットにフィルター先端を使用して P1000 ピペットと。各サンプル間ヒントを変更します。
注:中間期は壊れやすく、誤嚥が余りにすぐに行われる場合、上のフェーズを汚染できます。代わりに、中間期の不安の可能性を減らすために P200 ピペットを使用します。 - 各サンプルに 100% イソプロピル アルコール液 500 μ L を加え、15 秒の逆転によって混ぜます。
- 室温で 10 分間加温します。
- 4 ° C で 12 000 x g で 10 分間遠心分離し、チューブを室温にもたらします。イソプロパノールを破棄するには、各チューブの反転します。
注:小さな白い RNA ペレットは通常見ることが機会にない可能性があります。 - 各サンプルと簡単に渦に (100% エタノールと RNase フリーの水から調製した) 75% エタノール 1 mL を追加最大速度で各チューブ。
- 4 ° C で 7 500 × g で 5 分間遠心し、チューブを室温にもたらします。
- 各チューブの反転によって 75% エタノールを破棄し、に対して任意の残り物を削除する茶色の紙を軽くたたきます。
注:必要な場合は、RNA の餌に近いアルコールを取り除くフィルター チップを使用します。サンプル間ヒントを変更します。 - 蓋は開いたまま、空気約 15-20 分の RNA 沈殿を乾燥させます。
注:RNA のペレットは、このステップの間に半透明になる可能性があります。 - ペレットから RNA を可溶化はサイズに依存する、RNA を可溶化するために使用する RNase フリーの水の量を決定するペレットの大きさを評価します。各サンプルのボリューム (10 に 25 μ L) を書き留めます。
注:この手順は、単なる定性的です。RNA の餌を見ることができない場合は、サンプルに 10 μ L の RNA 無料水を追加します。 - RNase フリーの水の 10-25 μ L を各サンプル (3.24 の段階で事前に決定されたボリューム) に追加します。
- 60 ° C で熱ブロックで 5 分サンプルをインキュベートします。簡単に渦管。
- 60 ° C で同じ熱ブロックでさらに 5 分間サンプルをインキュベートします。
- クイック スピンのミニのすべてのサンプルの遠心分離機をスピンし、すぐに氷の上に置きます。
- RNA 濃度・純度を決定します。後で使用できる-80 ° C のフリーザーの逆のトランスクリプション (RT) cDNA の取得またはサンプルを保存を実行します。
注:これは RNA のサンプルを低下する複数の凍結/解凍サイクルを避けてください。
4. 脂肪 RNA 濃度・純度の測定
- かどうか脂肪 RNA サンプルされた挽きたて抽出可溶化または-80 ° C のフリーザーで保存済み、すべてのサンプルを収集し、プロシージャの先頭まで氷の上に解凍できるように。これは、次のステップまたは複数の凍結/解凍サイクルを避けるために分離の終わりの開始の直前に行ってください。
- 準備し RNase フリー 1.5 mL の円錐管の 2 つのセットを識別し、管ラックに入れてください。
- ときすべての RNA のサンプルが完全に解凍、渦 1 s と氷の上に置くのためのサンプルです。
- 希薄を使用して 1.5 mL の円錐形の管を RNase フリーの最初のセットで RNA 100 1 x テ ソリューション フィルター (1 x テ ソリューション 99 μ、1 μ L の RNA をチューブに入れて) RNase フリーのヒント。
- サンプルごとに繰り返します。
注:ボリュームは各分光光度計のキュヴェットによって使用のため異なる場合があります。 - すべてのサンプルが処理されると、各渦希釈したサンプル。
- 希薄化後の RNA のサンプルを処理する前にブランク (1 x TE) を使用して、計測器を校正する分光光度計のプロトコルに従ってください。
- 石英キュベットに希薄化後の RNA サンプルを転送し、260 で各サンプルの濃度を決定する nm。
注:分光光度計から、最終の RNA 濃度が提供されない場合を計算するこの数式を使用: RNA (μ g/μ L) = OD260 (40 μ g RNA/1 000 μ L) × 希釈倍率 ×。 - OD260/OD280比率を計算して、各サンプルの RNA の純度を決定します。
注:OD260/OD280 2.0 の周りの比率は、一般的に RNA12純粋として考慮されます。RNA の品質を検証することを強くお勧めします。1 x TBE バッファー (89 mM Tris ベース、89 mM ホウ酸、2 ミリメートルの EDTA、pH 8.0) で作られた 1% アガロースゲル漂白剤に RNA の 1 μ g を配置し、1% 漂白ソリューション13 (図 3)。非常に良い品質の RNA は 28 s、18 s rRNA のバンドを示し、28 秒バンドが 18 秒よりも強烈にする必要があります。RNA の品質が許容できるは、両方 rRNA のバンドが同じような強度で表示されています。RNA の品質は 18 歳のバンドは汚れが目に見える、RNA の劣化を示すと 28 秒バンドよりもより強い瞬間欠乏になります。 - 各サンプルでは、0.5 μ g/μ L の RNA RNase フリーの水を使用して必要に応じて、サンプルを希釈する RNase フリー 1.5 mL コニカル チューブの 2 番目のセットの在庫からの 10 μ L を準備します。これらのサンプルは、RT に cDNA を取得する使用されます。
- すべてのサンプルが処理されると、RT を開始または後で使用できる-80 ° C のフリーザーで試料を保存します。
5. 逆転写 (RT)
- 脂肪組織 RNA サンプル新鮮な 0.5 μ g/μ L に希釈された-80 ° C のフリーザーで保存済み、かどうかすべてのサンプル、および試薬を収集し、プロシージャの先頭まで氷の上に解凍できるように。
- 氷の上には、PCR チューブ ストリップ ラックを置きます。寒さは十分な準備し識別 RNase フリーの PCR の管の 1 つのセットはストリップし、ラックの上に置きます。空白が含まれます。
- RNA の DNase 治療反応の準備: 次の (サンプル + 1 サンプルの必要量) のマスター ミックスを行います (1 サンプルの量): MgCl2DNase 私 (1 U/μ l) と RNase フリー 7.5 μ L の水を使用しての 0.5 μ L 反応バッファー X 10 の 1 μ Lフィルターのヒント。各管内 9 μ L を分注します。
- 各ストリップとクイック スピン ミニ スピンのすべてのストリップ遠心管の底に、サンプルを持参して、キャップを入れて、対応する管に各サンプルから RNA の 0.5 μ g/μ L の 1 μ L を追加します。空白の無料の RNA 水 1 μ L を追加します。
- サーマルサイクラーまたは氷の上のラックの背面チューブ ストリップを入れて 30 分の 37 ° C で加熱ブロック内のすべてのチューブ ストリップを孵化させなさい。
- 各管に EDTA (50 mM) の 1 μ L を追加し、サーマルサイクラーまたは氷の上のラックの背面チューブ ストリップを入れて 10 分の 65 ° C で加熱ブロック内のすべてのチューブ ストリップをインキュベートします。
- 次の (サンプル 1 サンプルの必要な数) のマスター ミックスを行います (1 サンプルの量): ランダムな hexamers (0.2 μ g/μ L)、dNTP ミックス (各 10 mM の濃度で 4 つの弱まりを含む) の 1 μ L の 1 μ L。フィルター先端を使用して各チューブのマスターの組合せの 2 μ L 分注します。サンプル間ヒントを変更します。
- サーマルサイクラーまたはチューブ ストリップを氷の上のラックに戻して 5 分の 65 ° C で加熱ブロック内のすべてのチューブ ストリップを孵化させなさい。
- 次の (サンプル 1 サンプルの必要な数) のマスター ミックスを行います (1 サンプルの量): RT バッファー、RNase 阻害剤 (20 U/μ L) の 1 μ L、逆転写酵素 (200 U/μ L) の 0.25 μ L、ヌクレアーゼ フリー水の 1.75 μ L x 5 の 4 μ L。フィルター処理されたヒントを使用して各管内 7 μ L 分注します。サンプル間ヒントを変更します。
- 次のプログラムを設定することによって熱 cycler で RT を実行: 25 ° C、50 ° C、85 ° C で 5 分で 30 分で 10 分間氷の上のラックに戻って、チューブのストリップを置きます。
- 準備し RNase フリー PCR チューブ ストリップの 1 つセットを識別し、ラックの上に置きます。
- 各サンプルは、超純水を使用して新しいチューブ ストリップの在庫から 1:5 希釈 cDNA の適切なボリュームを準備します。1:5 希釈 cDNA サンプルは、リアルタイム PCR のため使用されます。
- すべてのサンプルが処理されると、リアルタイム PCR を開始または後で使用するための-20 ° C のフリーザーのサンプル (株式および希釈サンプル) を格納します。
6. 脂肪組織における発現遺伝子の PCR
注:光を蛍光色素を公開することは避けてください。以下のプロトコルでは、参照の遺伝子 s1614の増幅について説明します。プライマーと PCR の状態は、興味の遺伝子に従って修正されるべきです。
- 1:5 を希釈 cDNA サンプルが新鮮だったかどうかまたは-20 ° C のフリーザーで保存済み、すべての検体と試薬を収集し、プロシージャの先頭まで氷の上に解凍できるように。
- 氷の上リアルタイム PCR チューブ ストリップにラックを置きます。寒さは十分な準備し、リアルタイムの 1 セットを識別する PCR チューブが取り除き、ラックの上に置きます。各サンプルと重複して空白を準備します。
- 次の (サンプル 1 サンプルの必要な数) のマスター ミックスを行います (1 サンプルの量): 1.9 μ L の純水、蛍光色素 (例えば SYBR グリーン) の 5 μ L、前方のプライマーの 0.3 μ L と 0.3 μ L の逆のプライマー。各管で 7.5 μ L を分注します。
- 対応する管に各サンプルから 1:5 希釈 cDNA の 2.5 μ L を追加します。空白を純水の 2.5 μ L を追加します。各ストリップ上のキャップを置きます。
- リアルタイム PCR の次のプログラムを設定するのには、製造元の指示に従って: 95 ° C、15 の 40 のサイクルで 10 分 50 ° c、30 秒 60 ° c、30 秒 70 ° C に sリアルタイム PCR 機械の回転子にサンプル ストリップを入れ、プログラムを起動します。
注:サーマルサイクラーの条件は、使用される装置および興味の遺伝子によって異なります。mRNA 式結果は図 3をレプチン mRNA 増幅 S16 mRNA 増幅14,15参照の遺伝子によって正規化で提示します。
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Representative Results
剖検手順に従って 3 つの白色脂肪組織は収集されマウス (N と HF 食飼育マウス) の 2 つのグループから加重します。予想通り、心不全の食事療法のマウスは最終的な体重と同腹子 N ダイエット (表 1) と比較して体重を増加していた。これらの観察と一緒に伴われたよりも N 食事のものと比較して肥満マウスの PGF、PRF、および SCF の体重の 2 倍増加します。
隔離された RNA で実験を実行する前にその純度は手順 4.9 を評価しました。それぞれの白色脂肪組織のフェノール溶液による RNA の隔離は RNA (表 2) の純粋として考慮される OD260/OD280 が 2.0 前後比として十分な品質でサンプルを生産しました。リアルタイム PCR のデータは、レプチン mRNA 発現も PGF、PRF、N 食事 (図 4A) のものと比較して肥満のマウスの SCF で増加したことを示した。確かに、レプチン mRNA 発現に見られた差異は s16、Ct 値が変更されていないと、マウスの 2 つのグループ間の結果を正規化するために使用参照の遺伝子 (図 4B) の変化によるものでした。したがって、s16 確実に使用できます参照の遺伝子として、PGF、PRF、SCF mRNA 発現の場合、心不全の食事療法が研究プロトコルのパラメーター。
図 1.マウスの白色脂肪組織の解剖学的局在。各脂肪組織のデポおよび副腎のローカリゼーションを表示する N ダイエット男性マウスを解剖されています。SCF (A)、PGF (B)、PRF (C)および(D)副腎。PGF、ペリ-生殖腺脂肪;PRF、腎周囲脂肪;SCF、腹部の皮下脂肪。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.フェノール溶液を用いた RNA 分離プロトコル フロー チャート。接地の白色脂肪組織からの RNA を隔離するための手順の概略です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.漂白剤のゲルの RNA の品質評価。電気泳動による皮下脂肪 (SCF) とペリ-生殖腺脂肪 (PGF) から単離した RNA の 1 ug 1% アガロースゲル漂白剤に分かれています。28 s、18 s rRNA は、UV 光透視による可視化します。ゲルで、SCF とマウスの PGF から単離した RNA が通常の食事に供給されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4.白色脂肪組織で、s16 ではレプチンの mRNA 発現に及ぼす HF 食。レプチン、s16 で(A) (B)の mRNA 発現S16 のデータ、Ct 値として表示されます、両方がn平均 ± SE として提示、レプチンのデータが s16 mrna に正規化された = グループあたり 12-13。* p < 0.05 N ダイエットと比較して。N、通常;心不全、高脂肪。PGF、ペリ-生殖腺脂肪;PRF、腎周囲脂肪;SCF、腹部の皮下脂肪。この図は、タンから変更されている p.ら肥満 (2014) 22、2201-2209。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| N ダイエット | 心不全の食事療法 | |
| 最終体重 (g) | 37.5 ± 1.3 | 46.7 ± 1.7* |
| 体重 (g) | 6.6 ± 0.7 | 16.7 ± 1.0 * になります |
| PGF (g) | 1.08 ± 0.17 | 2.19 ± 0.15* |
| PRF (g) | 0.79 ± 0.15 | 1.71 ± 0.06* |
| SCF (g) | 1.62 ± 0.35 | 3.55 ± 0.20* |
テーブル 1。体と白の脂肪組織重量に及ぼす HF 食値はn ± SE を手段として表されます = グループあたり 14-15。* p < 0.05 N ダイエットと比較して。N、通常;心不全、高脂肪。PGF、ペリ-生殖腺脂肪;PRF、腎周囲脂肪;SCF、腹部の皮下脂肪。この図は、タンから変更されている p.ら肥満 (2014) 22、2201-2209。
| サンプル | 比 OD260/OD280 |
| PGF 1 | 2.04 |
| PGF 2 | 2.04 |
| PGF 3 | 2.02 |
| PRF 1 | 1.95 |
| PRF 2 | 2.08 |
| PRF 3 | 2.08 |
| SCF 1 | 2.04 |
| SCF 2 | 2.02 |
| SCF 3 | 2.06 |
表 2。RNA 純度白色脂肪組織から分離しました。 n = 3 脂肪組織ごと。PGF、ペリ-生殖腺脂肪;PRF、腎周囲脂肪;SCF、腹部の皮下脂肪。
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Discussion
次 HF 食事供給、肥満マウスは体と白色脂肪組織重量 N 飼料飼育マウスと比較して増加するいると見つけられました。フェノール溶液を使用して抽出した RNA 純度の良い試料が得られました。レプチンは主に脂肪組織によって生成、アデポカイン、脂肪質量16と正の相関が知られています。予想通り、自分の脂肪の塊な肥満マウスにおけるレプチン mRNA の発現が増加しました。
このメソッドは、いくつかの重要な手順です。主要である別の 1 つの白色脂肪組織のデポの汚染さまざまな機能2,5を別の脂肪組織の拠点にいる知られています。汚染は、下流のアプリケーションで、誤解を招く結果をもたらすことができます。さらに、脂肪は、一度マウスの間に定期的かつ一貫したペースで白色脂肪組織を収集、空気との接触に乾燥する傾向があるお勧めかどうか重量は取られる必要があります。そうでなければ、脂肪パッドの総重量は正しいかもしれない。最近公開された MIQE、次の良い品質と収量、RNA を得るためには、ガイドラインは明確な資産17です。特に、研削中に非常に細かいサンプル粉末を作ると収量を最大化するために助けることができます。これは RNA の隔離の中に組織の粉とフェノール溶液との接触を最大化します。最後にではなく、少なくともは RNA の隔離 (ステップ 3.12) の中に RNA 含有層の分離です。脂肪は水よりも密度が低く、それは興味の段階の上に配置されています。脂肪のキャリー オーバーを最小限に抑えることは、下流のアプリケーションとの干渉を減らすために必要です。
このメソッドの制限の 1 つは、手順だけでなく、RNA の隔離の中に有害な試薬を使用する必要があるいくつかの手順を実行するために必要なスキルです。また、全体のプロセスは労働集約的であります。
脂肪組織の採取とサンプルが通常各ユーザによって調整される細部から離れて RNA 分離前に処理の方法に多くの選択肢があります。RNA の隔離の場合、フェノール/クロロホルム抽出または RNA 分離キットなど多くのオプションがあります。オプションごとに長所と短所があり、下流のアプリケーションに最適な手法を選択するユーザー次第です。フェノール/クロロホルム抽出は安価が有害試薬の使用を必要とする、骨の折れる。RNA 分離キットは通常より高価なしかし、プロシージャは高速と通常は良い品質と純度とサンプルを生みます。材料は脂肪の主にで構成される白色の脂肪組織に限られるので、収量および RNA の純度を考慮することが重要です。分離 (フェノール/クロロホルム抽出) のフェノールの解決を使用しての主な利点は、単一サンプル18からの蛋白質、DNA、RNA を分離する可能性です。これは、十分な材料を取得する必要があるマウスの数が減るためコストと時間の効率です。前述のように、脂肪の塊がいくつかマウス モデルで制限されます。これらのマウスの地面脂肪組織を RNA、DNA とタンパク質を別々 に取得する 3 つの部分に分割は推奨されません、ダウン ストリーム アプリケーションが不足している資料につながる可能性があります。この問題を回避するためにも必要な動物数の増加につながるユーザー定義の基準に基づいていくつかのマウスからと同様の脂肪デポでプールに一緒に可能としてます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、糖尿病カナダによって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL seringes | |||
| 1X TE solution (10 mM Tris-HCl and 1 mM EDTA•Na2. pH 8.0) | |||
| 22 G needles | |||
| 26 G needles | |||
| 75% Ethanol | |||
| Block heater (dry bath) | |||
| Chloroform | Sigma | C2432-500mL | |
| dATP | Thermo scientific | R0141 | |
| dCTP | Thermo scientific | R0151 | |
| dGTP | Thermo scientific | R0161 | |
| DNase I (1 U/µl) | Thermo scientific | EN0521 | |
| dTTP | Thermo scientific | R0171 | |
| Faststart Universal SYBR green Master (Rox) | Roche | 4913922001 | |
| Faststart universal SYBR green master (Rox) fluorescent dye | Roche | 4913914001 | |
| Filtered tips | |||
| Forceps | Instrumentarium | HB275 | |
| Gauze | |||
| Hammer | |||
| High fat rodent diet | Bio-Serv, Frenchtown, NJ | F3282 | |
| Isopropanol | Laboratoire MAT | IH-0101 | |
| Leptin forward PCR primer (5’-GGGCTTCACCCCATTCTGA-3’) 10 uM | |||
| Leptin reverse PCR primer (5’-GGCTATCTGCAGCACATTTTG-3’) 10 uM | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Maxima Reverse Transcriptase (enzyme and 5x buffer) | Thermo scientific | EP0742 | |
| Nanopure water (referred as ultrapure water) | |||
| Nitrile examination gloves | |||
| Nitrile gloves | |||
| Normal rodent diet | Harlan Laboratories, Madison, WI | Harlan 2018 | |
| P1000 pipetman | |||
| P2 pipetman | |||
| P20 pipetman | |||
| P200 pipetman | |||
| Phenol solution (TRIzol) | Ambion Life Technologies | 15598018 | |
| Pre-identified aluminium foil | |||
| Quartz spectrophotometer cuvette | |||
| Rack for PCR tube strips | |||
| Racks for RT-PCR tube strips | |||
| Random hexamers | Invitrogen | 58875 | |
| Real-time PCR Rotor Gene system | Corbett research | RG-3000 Rotor-Gene thermal cycler | |
| Refrigerated bench-top centrifuge | |||
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo scientific | EO0381 | |
| RNase-free 1.5 mL eppendorf tubes | |||
| RNase-free 1.5 mL screw cap tubes | |||
| RNase-free PCR tube strips (0.2 mL) and caps | |||
| RNase-free water | Hyclone | SH30538.02 | |
| RT-PCR machine | Qiagen | Rotor-Gene Corbett 3000 | |
| RT-PCR tube strips (0.1 mL) and caps | |||
| S16 forward PCR primer (5’-ATCTCAAAGGCCCTGGTAGC-3’) 10 uM | |||
| S16 reverse PCR primer (5’ ACAAAGGTAAACCCCGATCG-3’) 10 uM | |||
| Spectrophotometer | Biochrom | Ultrospec 3100 pro | |
| Stainless steel mortar and pestle | |||
| Surgical pads | Home made a foam board wrapped in a disposable absorbent underpad | ||
| Surgical scissors | Intrumentarium | 130.450.11 | |
| Thermal cycler | |||
| Thermal cycler | Biometra | Thermocycler | |
| Vortex mixer | |||
| Weighing spatula |
References
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