Maus Fettgewebe Erhebung und Verarbeitung für die RNA-Analyse
Summary
Dieses Papier soll eine schrittweise Anleitung zu sammeln verschiedene weißen Fettgewebe von Mäusen, die Fett Proben zu verarbeiten und RNA extrahieren zu präsentieren.
Abstract
Im Vergleich zu anderen Geweben, hat weißen Fettgewebe einen deutlich weniger RNA und Protein Inhalt für downstream-Anwendungen wie Real-Time PCR und Western-Blot, da es meist Lipide enthält. RNA Isolation aus Fettgewebe Proben ist auch herausfordernd, da zusätzliche Schritte erforderlich sind, um diese Lipide zu vermeiden. Hier präsentieren wir Ihnen ein Verfahren um drei anatomisch unterschiedlichen weißen Fettgewebe von Mäusen, verarbeiten diese Proben und durchführen von RNA Isolierung zu sammeln. Wir beschreiben weiter die Synthese der cDNA und gen-Ausdruck-Experimente mittels Real-Time PCR. Das hiermit beschriebene Protokoll ermöglicht die Reduzierung der Kontamination von Haar und Blut auf Fettpolster sowie Cross-Kontamination zwischen verschiedenen Fettpolster bei der Entnahme von Gewebe des Tieres. Es wurde auch optimiert, um angemessene Quantität und Qualität der extrahierten RNA zu gewährleisten. Dieses Protokoll kann weit angewendet werden, um jede Maus-Modell wo Fettgewebe Proben für routinemäßige Experimente wie Real-Time PCR erforderlich sind, aber ist nicht zur Isolation von primären Adipozyten Zellkultur.
Introduction
Adipositas ist eine weltweite Epidemie Komplikationen wie Typ 2 Diabetes1führen kann. Diät-induzierten fettleibig und gentechnisch veränderten Tiermodelle sind häufig in Übergewicht und die damit verbundenen Komplikationen für die Forschung verwendet. Traditionell weißen Fettgewebe ist bekannt als ein Ablagefach für überschüssige Energie und besteht hauptsächlich aus Lipiden während braunes Fettgewebe Energie in Wärme2,3 wandelt. Fettgewebe ist dynamisch erweitern und verkleinern abhängig von vielen Faktoren wie Ernährung und körperliche Aktivität. Um Faktoren auf diese Veränderungen zu bestimmen, sind daher ausreichend Fettgewebe Erhebung und Verarbeitung erforderlich4.
Unter weißen Fettgewebe ist es allgemein anerkannt, dass viszeralen und subkutanen Fettdepots unterschiedliche Eigenschaften wie die anatomische Lokalisierung haben und Funktion2,5. Folglich muss zur Vermeidung von widersprüchlichen Ergebnissen oder große Variabilität Aufmerksamkeit getroffen werden, um Kreuzkontaminationen zwischen diesen verschiedenen Fettdepots beim Fettpolster zu sammeln.
Darüber hinaus gibt es drei große Herausforderungen, wenn Sie RNS oder Protein aus Mäusen weißen Fettgewebe zu isolieren. Erstens ist die Fettpolster bei fettleibigen Mäusen sammeln nicht leichte Aufgabe wie die Grenze trennt verschiedene weiße Fettdepots nicht immer klar, im Gegensatz zu anderen Organen wie Niere und Herz6. Zweitens wegen der hohen Fettgehalt des Fettgewebes, während RNS oder Protein isoliert, eine Schicht von Lipiden obenauf schwimmt und verhindert den direkten Zugriff auf die Probe. Drittens: im Gegensatz zu braunen Fettgewebe oder anderen Geweben, weißen Fettgewebe hat erheblich niedrigeren Gehalt an RNA und Protein und dies ist von großer Bedeutung bei der Verwendung von junger Mäusen, Mäuse eine normale (N) Diät gefüttert und Mäuse, die voraussichtlich haben geringe Dicke Massen (d.h. KO Modelle, Behandlung mit Medikamenten, Übung, Training, etc..) 7 , 8.
Daher ist es wichtig, auswählen der geeigneten Methode, die RNA aus Fettgewebe zu isolieren. Alternative Methoden zur Phenol/Chloroform Extraktion sind kommerzielle Kits. Sie basieren in der Regel auf eine anfängliche Phenol Extraktionsschritt, gefolgt von RNA-Reinigung auf eine Spalte9. Diese Kits sind in der Regel teurer und Proben von geringeren Ertrag zu geben, während die RNA-Qualität Variable möglicherweise jedoch sind weniger zeitaufwändig. Einer der größten Vorteile der Phenol-Lösung/Chloroform Extraktion hier beschriebene ist jedoch die Möglichkeit der Isolierung von RNA, DNA und Proteine aus einer einzigen Probe10. Da Mäuse Fettpolster meist klein sind und kleine Menge von RNA und Proteinen (insbesondere schlanke Maus-Modellen geben), maximieren Sie diese Protokolle die Daten, die man aus einer kleinen Probe abbekommt.
Das Ziel dieses Papiers ist es, im Detail beschreiben eine Methode, um adäquate Probenentnahme aus drei Mäuse weißen Fettgewebe Depots sowie Menge und Qualität der RNA Isolierung zu gewährleisten. RNA durch Anschluss an dieses Protokoll erhalten kann verwendet werden, um Echtzeit-PCR-Tests durchzuführen. Dieses Protokoll dient nicht zur RNA-Isolierung aus kultivierten primäre Adipozyten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fettleibige Mäusen ergab folgenden HF-Diät ernähren, Körper und weißen Fettgewebe Gewichte im Vergleich zu Mäusen eine N-Diät gefüttert zugenommen haben. RNA mit Phenol Lösung ergab Proben mit guter Reinheit extrahiert. Leptin ist ein Adipokine produziert in erster Linie von Fettgewebe und positiv korrelieren mit fat mass16bekannt. Wie erwartet erhöht Leptin mRNA Ausdruck bei fettleibigen Mäusen in Tateinheit mit ihrer Fettmasse.
Diese Methode hat mehrere wic…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von Diabetes Kanada unterstützt.
Materials
| 1 mL seringes | |||
| 1X TE solution (10 mM Tris-HCl and 1 mM EDTA•Na2. pH 8.0) | |||
| 22 G needles | |||
| 26 G needles | |||
| 75% Ethanol | |||
| Block heater (dry bath) | |||
| Chloroform | Sigma | C2432-500mL | |
| dATP | Thermo scientific | R0141 | |
| dCTP | Thermo scientific | R0151 | |
| dGTP | Thermo scientific | R0161 | |
| DNase I (1 U/µl) | Thermo scientific | EN0521 | |
| dTTP | Thermo scientific | R0171 | |
| Faststart Universal SYBR green Master (Rox) | Roche | 4913922001 | |
| Faststart universal SYBR green master (Rox) fluorescent dye | Roche | 4913914001 | |
| Filtered tips | |||
| Forceps | Instrumentarium | HB275 | |
| Gauze | |||
| Hammer | |||
| High fat rodent diet | Bio-Serv, Frenchtown, NJ | F3282 | |
| Isopropanol | Laboratoire MAT | IH-0101 | |
| Leptin forward PCR primer (5’-GGGCTTCACCCCATTCTGA-3’) 10 uM | |||
| Leptin reverse PCR primer (5’-GGCTATCTGCAGCACATTTTG-3’) 10 uM | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Maxima Reverse Transcriptase (enzyme and 5x buffer) | Thermo scientific | EP0742 | |
| Nanopure water (referred as ultrapure water) | |||
| Nitrile examination gloves | |||
| Nitrile gloves | |||
| Normal rodent diet | Harlan Laboratories, Madison, WI | Harlan 2018 | |
| P1000 pipetman | |||
| P2 pipetman | |||
| P20 pipetman | |||
| P200 pipetman | |||
| Phenol solution (TRIzol) | Ambion Life Technologies | 15598018 | |
| Pre-identified aluminium foil | |||
| Quartz spectrophotometer cuvette | |||
| Rack for PCR tube strips | |||
| Racks for RT-PCR tube strips | |||
| Random hexamers | Invitrogen | 58875 | |
| Real-time PCR Rotor Gene system | Corbett research | RG-3000 Rotor-Gene thermal cycler | |
| Refrigerated bench-top centrifuge | |||
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo scientific | EO0381 | |
| RNase-free 1.5 mL eppendorf tubes | |||
| RNase-free 1.5 mL screw cap tubes | |||
| RNase-free PCR tube strips (0.2 mL) and caps | |||
| RNase-free water | Hyclone | SH30538.02 | |
| RT-PCR machine | Qiagen | Rotor-Gene Corbett 3000 | |
| RT-PCR tube strips (0.1 mL) and caps | |||
| S16 forward PCR primer (5’-ATCTCAAAGGCCCTGGTAGC-3’) 10 uM | |||
| S16 reverse PCR primer (5’ ACAAAGGTAAACCCCGATCG-3’) 10 uM | |||
| Spectrophotometer | Biochrom | Ultrospec 3100 pro | |
| Stainless steel mortar and pestle | |||
| Surgical pads | Home made a foam board wrapped in a disposable absorbent underpad | ||
| Surgical scissors | Intrumentarium | 130.450.11 | |
| Thermal cycler | |||
| Thermal cycler | Biometra | Thermocycler | |
| Vortex mixer | |||
| Weighing spatula |
References
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