此胰岛分离方案描述了胶原酶注射以消化外分子组织的新途径,以及从小鼠中纯化胰岛的简化梯度程序。它涉及酶消化,梯度分离/纯化,和小岛手工采摘。成功的隔离可以产生250~350个高质量和全功能的小岛每只鼠标。
胰腺胰岛,也称为兰格汉斯岛,是一组内分泌细胞,产生用于葡萄糖调节和其他重要生物功能的激素。胰岛主要由五种类型的激素分泌细胞组成:β细胞分泌胰高血糖素,β细胞分泌胰岛素,β细胞分泌生长激素,β细胞分泌ghrelin,PP细胞分泌胰腺多肽。胰岛中60%至80%的细胞是β细胞,这是研究胰岛素分泌的最重要细胞群。胰腺胰岛是研究体外胰岛素分泌的重要模型系统。获得高质量的胰岛对糖尿病研究具有重要意义。大多数小岛分离程序需要技术上难以进入胶原酶注射部位、苛刻和复杂的消化程序以及多个密度梯度纯化步骤。本文采用一种简单的高产小鼠胰岛隔离方法,具有详细的描述和真实的演示,显示了以下具体步骤:1)在Vater的ampulla注射胶原酶P,一个连接胰腺导管的小区域,常见的胆管,2)酶消化和机械分离的外分子胰腺,和3)单梯度纯化步骤。这种方法的优点是使用更易访问的 Vater ampulla 注射消化酶,使用酶和机械方法的组合进行更完整的消化,以及更简单的单梯度纯化步骤。该协议每只鼠标产生大约 250-350 个小岛;和小岛适合各种活体研究。此过程的可能警告是由于酶消化和/或长时间的梯度孵育而可能损坏的小岛,所有这些可以通过仔细说明孵育时间来避免。
文献中有两种常见的胰岛隔离方法。一个要求切除胰腺,并用手术剪刀切成小块,然后消化在胶原酶溶液1,2,3。另一种更精确的方法是使用胰腺中的导管网络来引入消化酶。以下部位已用于消化酶注射:胆汁和囊性导管的结点,胆囊进入普通胆管,或普通胆管本身1,4,5。众所周知,胰岛在胰腺中分布不均匀;脾功能区域包含最多的胰岛6。虽然第二种方法使用解剖途径提供消化酶允许更完整的灌注胰腺,包括脾科区域,但此过程通常需要夹紧或缝合从技术上讲的 Vater 的 ampulla挑战。在胰岛纯化方面,使用多密度梯度以及细胞滤网和磁缩器来纯化胰岛3、7。这些梯度的利用可能非常耗时,而菲科尔梯度可能导致小岛8的毒性损伤。
目前的协议是建立在李等人描述的方法之上的,根据我们自己和其他人的经验,增加了额外的修改。我们协议最关键的步骤是夹紧靠近肝端的普通胆管,通过Vater的ampulla注射胶原酶P来消化外分明组织,然后用摇动的水浴以机械方式加速消化1。 4,7.随后,应用”STOP”溶液抑制胰岛的进一步消化;HBSS 用于洗掉剩余的胶原酶 P 和 STOP 溶液。当Ficoll方法用于纯化人类胰岛时,据报道,与使用Percoll梯度9相比,具有更大功能能力(例如胰岛素分泌)的胰岛的产量是两倍。然而,研究已经质疑使用菲科尔梯度,由于其毒性作用的小岛1,10。据介绍,Histopaque梯度为小鼠胰岛隔离提供了最佳的纯化动力学,具有更简单的步骤和更低的成本,可产生高质量的胰岛的良好产量。在我们的协议中,Histopaque-1077用于从其他残余组织8,11中纯化胰岛。收获的小岛可以在完整的RPMI-1640培养基培养,或直接用于RNA/蛋白质定量。
我们的协议,使用胶原酶P消化和单梯度纯化步骤的组合,比其他已公布的协议更简单。我们的方法不需要苛刻的外科手术,只有几个简单的步骤。更重要的是,正如我们报道的12中那样,该协议始终能产生高质量的功能胰岛(250-350/鼠标)的良好产量。
该协议包括胶原酶灌注和消化,然后是胰岛纯化。该协议最关键的步骤是有效的注射和完全灌注胰腺1,4,7。该协议的传递方法允许酶穿过解剖途径,以更好地消化胰岛1周围的外分子组织。此外,该技术非常适合完全消化脾功能区域,其中胰岛浓度最高,为4,6。?…
The authors have nothing to disclose.
我们非常感谢詹妮弗·蒙吉亚女士对原理图的艺术插图。我们感谢休斯敦社区公共广播电台KPFT的迈克尔·霍尼格先生的编辑协助。这项研究得到了美国糖尿病协会#1-15-BS-177(YS)和NIH R56DK118334/R01DK118334(YS)的支持。这项工作还得到了美国农业部国家粮食和农业研究所、Hatch项目1010840(YS)和R01 DK095118(SG)的支持。
3 mL syringe | BD | 309657 | Hoding collagenase P |
Coverglass forceps | VWR | 82027-396 | Holding skin of mouse to aid incision procedure |
Curved forceps | Sigma-Aldrich | Z168696 | Holding tissues during pancreas removal |
Isoflurane | Piramal | B13B16A | To anaesthetize mice prior surgery |
100 mm petri dishes | VWR | 30-2041 | Used for islet culture |
30 G. ½ inch needle | BD | 305106 | For penetration of Ampulla of vater to deliver Collagenase P – this guage is used as it fits well in most CBDs |
50ml tube | VWR | 89039-658 | Holding digested pancreatic tissue, collagenase P, and purified islets |
Absorbent pads with waterproof moisture barrier | VWR | 82020-845 | To absorb blood from syurgical procesdudes |
Centrifuge 5810R with swing bucket and deceleration capability | Eppendorf | 5811FJ478114 | Use for pelleting tissues, pellet is formed at bottom of conical tube – swing bucket centrifuge is needed. Also the decelaration feature is important to form the gradient layers. |
Collagenase P- 1g | Roche Diagnostics | 11249002001 | For digestion of exocrine pancreas |
Curved surgical scissors | Fisher-Scientific | 13-804-21 | For cutting open mouse abdomen |
Dissection microscope | Olympus | SZX16 | Used for identification of key anatomical structures to accurately deliver collagenase into pancreas |
Hank's Balanced Salt Solution 10x | Corning | 20-023-CV | Washing cells |
Histopaque-1077 | Sigma | RNBF5100 | For gradient formation |
Light source | Leeds | LR92240 | Enhancing visibility of microscope |
RNaseZap | Fisher-Scientific | AM9780 | For removing RNase |
RPMI-1640 Media w/o L-Glutamine | Corning | 15-040-CV | Culturing Islets |
Schwartz micro serrefines (Microvascular clamp) | Fine Science Tools | 18052-01 | Clamping common bile duct and hepatic artery |
Shaking waterbath | Boekel/Grant | 8R0534008 | Important for mechanical digestion of exocrine tissue |
Small surgical scissors | VWR | 82027-578 | Cuttitng tissue that atached to pancreas |