Um protocolo de alta eficiência simples para isolamento de Islet pancreático de camundongos
Summary
Este protocolo da isolação da ilhotas descreveu uma rota nova da injeção do colagenase para digerir o tecido exócrina e um procedimento simplificado do inclinação para purificar os ilhotas dos ratos. Envolve a digestão enzimática, separação de gradiente/purificação, e Islet mão-picking. O isolamento bem-sucedido pode produzir 250 – 350 de alta qualidade e ilhotas totalmente funcionais por mouse.
Abstract
As ilhotas pancreáticas, também chamadas de Ilhéus de Langerhans, são um aglomerado de células endócrinas que produz hormônios para a regulação da glicose e outras funções biológicas importantes. As ilhotas consistem principalmente em cinco tipos de células secreting-hormonais: células α secretam glucagon, células β secretam insulina, células δ secretam somatostatina, ε células secretam grelina, e células PP secretam polipeptídeo pancreático. 60 a 80% das células nas ilhotas são células β, que são a população celular mais importante para estudar a secreção de insulina. As ilhotas pancreáticas são um sistema de modelo crucial para estudar a secreção de insulina ex vivo. Adquirir ilhotas de alta qualidade é de grande importância para a pesquisa de diabetes. A maioria dos procedimentos de isolamento de Islet requer tecnicamente difícil de acessar o local de injeção de colagenase, procedimentos de digestão duras e complexas, e etapas de purificação de gradiente de densidade múltipla. Este papel caracteriza um método simples do isolamento do Islet do rato do rendimento elevado com descrições detalhadas e manifestações realísticas, mostrando as seguintes etapas específicas: 1) injeção do colagenase P no ampulla de Vater, uma área pequena que se juntar ao duto pancreatic e o ducto biliar comum, 2) digestão enzimática e separação mecânica do pâncreas exócrino, e 3) uma única etapa de purificação de gradiente. As vantagens deste método são a injeção da enzima digestiva usando a ampola mais acessível de Vater, digestão mais completa usando a combinação de abordagens enzimáticas e mecânicas, e um passo simples de purificação de gradiente único. Este protocolo produz aproximadamente 250 — 350 ilhotas por o rato; e ilhotas são adequados para vários estudos ex vivo. Possíveis advertências deste procedimento são ilhotas potencialmente danificadas devido à digestão enzimática e/ou incubação prolongada de gradiente, todas as quais podem ser largamente evitadas pela justificação cuidadosa do anúncio do tempo de incubação.
Introduction
Há dois métodos comuns na literatura para o isolamento da ilíte pancreática. Um exige excisão o pâncreas e o dicing em partes pequenas usando tesouras cirúrgicas, e então digerindo o em uma solução1,2,3do colagenase. Outro método mais preciso é usar a rede de dutos presentes no pâncreas para introduzir a enzima digestiva. Os seguintes locais foram usados para a injeção digestiva da enzima: a junção da bilis e do duto cístico, a vesícula biliar no colagogo comum, ou o colagogo comum próprio1,4,5. Sabe-se que as ilhotas não são distribuídas uniformemente no pâncreas; a região esplênica contém a maioria das ilhotas6. Enquanto o segundo método usando rotas anatômicas para entregar enzimas digestivas permite uma perfusão mais completa do pâncreas, incluindo a região esplênica, este procedimento muitas vezes requer o aperto ou sutura da ampola de Vater que é tecnicamente Desafiador. Em termos de purificação de ilhós, gradientes de densidade múltipla, bem como filtros celulares e retração magnética têm sido utilizados para purificar as ilhotas3,7. A utilização desses gradientes pode ser demorada e os gradientes de Ficoll podem resultar em dano tóxico das ilhotas8.
O protocolo atual é construído sobre o método descrito por Li et al.7, com modificações adicionais adicionadas com base na experiência de nós mesmos e de outros1,4. As etapas mais críticas do nosso protocolo são o aperto do ducto biliar comum perto da extremidade do fígado, injetando colagenase P através da ampola de Vater para digerir o tecido exócrino e, em seguida, usando um banho de água agitando para agilizar a digestão mecanicamente1, 4,7. Subseqüentemente, uma solução do “batente” é aplicada para inibir uma digestão mais adicional das ilhotas; HBSS é utilizado para lavar a solução remanescente de colagenase P e STOP. Quando o método de Ficoll foi usado para purificar as ilhotas humanas, o rendimento foi relatado para ser duas vezes as ilhotas com maior capacidade funcional (por exemplo, secreção de insulina) em comparação com o uso de gradientes de Percoll9. No entanto, estudos têm questionado o uso do gradiente Ficoll devido ao seu efeito tóxico nas ilhotas1,10. Relatou-se que o gradiente histopaque fornece a cinética óptima da purificação para a isolação da ilhotas do rato, que produz o bom rendimento de ilhotas da alta qualidade com etapas mais simples e um mais baixo custo1. Em nosso protocolo, o Histopaque-1077 é usado para purificar ilhotas de outros tecidos residuais8,11. As ilhotas colhidas podem ser cultivadas em meios completos de RPMI-1640, ou utilizadas diretamente na quantificação de RNA/proteína.
Nosso protocolo, usando uma combinação de digestão do colagenase P e uma única etapa da purificação do inclinação, é mais simples do que outros protocolos publicados. Nosso método não exige procedimentos cirúrgicos exigentes e tem apenas alguns passos simples. Mais importante, este protocolo consistentemente produz um bom rendimento de ilhotas funcionais de alta qualidade (250-350/mouse) como nós relatado12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo inclui perfusão de colagenases e digestão, seguida de purificação de ilhotas. As etapas mais críticas deste protocolo são a injeção efetiva e a perfusão completa do pâncreas1,4,7. O método de parto deste protocolo permite que a enzima atravesse as vias anatômicas para melhor digerir o tecido exócrino que circunda as ilhotas1. Além disso, esta técnica é bem adequada para a di…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos extremamente gratos à Sra. Jennifer Munguia por sua ilustração artística do diagrama esquemático. Agradecemos ao Sr. Michael R. Honig na estação de rádio pública da comunidade de Houston KPFT por sua assistência editorial. Este estudo foi apoiado pela American Diabetes Association #1-177 (YS), e NIH R56DK118334/R01DK118334 (YS). Este trabalho também foi apoiado pelo Instituto Nacional de alimentação e agricultura do USDA, projeto Hatch 1010840 (YS) e R01 DK095118 (SG).
Materials
| 3 mL syringe | BD | 309657 | Hoding collagenase P |
| Coverglass forceps | VWR | 82027-396 | Holding skin of mouse to aid incision procedure |
| Curved forceps | Sigma-Aldrich | Z168696 | Holding tissues during pancreas removal |
| Isoflurane | Piramal | B13B16A | To anaesthetize mice prior surgery |
| 100 mm petri dishes | VWR | 30-2041 | Used for islet culture |
| 30 G. ½ inch needle | BD | 305106 | For penetration of Ampulla of vater to deliver Collagenase P – this guage is used as it fits well in most CBDs |
| 50ml tube | VWR | 89039-658 | Holding digested pancreatic tissue, collagenase P, and purified islets |
| Absorbent pads with waterproof moisture barrier | VWR | 82020-845 | To absorb blood from syurgical procesdudes |
| Centrifuge 5810R with swing bucket and deceleration capability | Eppendorf | 5811FJ478114 | Use for pelleting tissues, pellet is formed at bottom of conical tube – swing bucket centrifuge is needed. Also the decelaration feature is important to form the gradient layers. |
| Collagenase P- 1g | Roche Diagnostics | 11249002001 | For digestion of exocrine pancreas |
| Curved surgical scissors | Fisher-Scientific | 13-804-21 | For cutting open mouse abdomen |
| Dissection microscope | Olympus | SZX16 | Used for identification of key anatomical structures to accurately deliver collagenase into pancreas |
| Hank's Balanced Salt Solution 10x | Corning | 20-023-CV | Washing cells |
| Histopaque-1077 | Sigma | RNBF5100 | For gradient formation |
| Light source | Leeds | LR92240 | Enhancing visibility of microscope |
| RNaseZap | Fisher-Scientific | AM9780 | For removing RNase |
| RPMI-1640 Media w/o L-Glutamine | Corning | 15-040-CV | Culturing Islets |
| Schwartz micro serrefines (Microvascular clamp) | Fine Science Tools | 18052-01 | Clamping common bile duct and hepatic artery |
| Shaking waterbath | Boekel/Grant | 8R0534008 | Important for mechanical digestion of exocrine tissue |
| Small surgical scissors | VWR | 82027-578 | Cuttitng tissue that atached to pancreas |
References
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