Een eenvoudig hoog rendement protocol voor isolatie van de alvleesklier eiland van muizen
Summary
Dit eilandje isolatie protocol beschreef een roman route van Collagenase injectie om het exocriene weefsel te verteren en een vereenvoudigde gradiënt procedure om de eilandjes van muizen te zuiveren. Het gaat om enzymatische spijsvertering, gradiënt scheiding/zuivering en eilandje hand-picking. Succesvolle isolatie kan 250 – 350 hoge kwaliteit en volledig functionele eilandjes per muis opleveren.
Abstract
Pancreas eilandjes, ook wel de eilandjes van Langerhans, zijn een cluster van endocriene cellen die hormonen produceert voor glucoseregulatie en andere belangrijke biologische functies. De eilandjes bestaan hoofdzakelijk uit vijf soorten hormonen-afscheidende cellen: α-cellen scheiden glucagon, β-cellen scheiden insuline, δ cellen scheiden Somatostatine, ε cellen afscheiden ghreline, en PP cellen scheiden alvleesklier polypeptide. 60 tot 80% van de cellen in de eilandjes zijn β-cellen, die de belangrijkste celpopulatie zijn om de insuline secretie te bestuderen. Pancreatic eilandjes zijn een cruciaal modelsysteem om ex vivo insuline secretie te bestuderen. Het verwerven van hoge kwaliteit eilandjes is van groot belang voor diabetesonderzoek. De meeste eilandje isolatie procedures vereisen technisch moeilijk te benaderen site van Collagenase injectie, harde en complexe spijsvertering procedures, en meerdere dichtheid gradiënt zuivering stappen. Dit papier is voorzien van een eenvoudige, hoge opbrengst muis eiland isolatiemethode met gedetailleerde beschrijvingen en realistische demonstraties, met de volgende specifieke stappen: 1) injectie van Collagenase P bij de Papil van Vater, een klein gebied dat lid wordt van de alvleesklier en de Galgang, 2) enzymatische vertering en mechanische scheiding van de exocriene alvleesklier, en 3) een enkele gradiënt zuiveringsstap. De voordelen van deze methode zijn de injectie van spijsverterings enzym met behulp van de toegankelijker Papil van Vater, completere spijsvertering met behulp van combinatie van enzymatische en mechanische benaderingen, en een eenvoudigere enkele gradiënt zuivering stap. Dit protocol produceert ongeveer 250 — 350 eilandjes per muis; en eilandjes zijn geschikt voor verschillende ex vivo-studies. Mogelijke waarschuwingen van deze procedure zijn potentieel beschadigde eilandjes als gevolg van enzymatische spijsvertering en/of langdurige gradiënt incubatie, die allemaal grotendeels kunnen worden vermeden door zorgvuldige advertentie-rechtvaardiging van incubatietijd.
Introduction
Er zijn twee veelgebruikte methoden in de literatuur voor de isolatie van de eiland alvleesklier. Men vereist het exciseren van de alvleesklier en het diceren in kleine stukjes met behulp van chirurgische schaar, en vervolgens verteerd in een Collagenase oplossing1,2,3. Een andere preciezere methode is het gebruik van het netwerk van kanalen aanwezig in de alvleesklier te introduceren spijsverterings enzym. De volgende sites zijn gebruikt voor de digestieve enzym injectie: de kruising van de gal en Cystic duct, de galblaas in de Galgang, of de gemeenschappelijke gal duct zelf1,4,5. Het is bekend dat eilandjes niet gelijkmatig worden verdeeld in de alvleesklier; de regio milt bevat de meeste eilandjes6. Terwijl de tweede methode met behulp van anatomische routes voor het leveren van spijsverteringsenzymen zorgt voor een vollediger perfusie van de alvleesklier, met inbegrip van de milt regio, deze procedure vereist vaak klemmen of het versterken van de Papil van Vater die technisch Uitdagende. In termen van de zuivering van het eilandje, zijn meerdere dichtheidsgradiënten, evenals celstrainers en magnetische terugtrekking gebruikt om de eilandjes op3,7te zuiveren. Het gebruik van deze gradiënten kan tijdrovend zijn en de Ficoll gradiënten kunnen leiden tot toxische schade aan eilandjes8.
Het huidige protocol is gebaseerd op de methode die wordt beschreven door Li et al.7, met aanvullende wijzigingen toegevoegd op basis van de ervaring van onszelf en anderen1,4. De meest kritische stappen van ons protocol zijn het klemmen van de galwegen in de buurt van het lever uiteinde, het injecteren van Collagenase P via de Papil van Vater om het exocriene weefsel te verteren en vervolgens een schud waterbad te gebruiken om de spijsvertering mechanisch te versnellen1, 4,7. Vervolgens wordt een ‘ STOP’-oplossing toegepast om de verdere vertering van de eilandjes te remmen; HBSS wordt gebruikt om de resterende Collagenase P-en STOP oplossing af te spoelen. Wanneer de Ficoll-methode werd gebruikt om menselijke eilandjes te zuiveren, werd de opbrengst gerapporteerd als tweemaal de eilandjes met een grotere functionele capaciteit (bijv. insuline secretie) in vergelijking met het gebruik van Percoll gradiënten9. Studies hebben echter het gebruik van Ficoll gradiënt betwist vanwege het toxische effect op de eilandjes1,10. Er is gemeld dat de histopaque gradiënt optimale zuiverings kinetiek biedt voor het isoleren van muizen eilandjes, wat een goede opbrengst oplevert van hoogwaardige eilandjes met eenvoudigere stappen en lagere kosten1. In ons protocol wordt Histopaque-1077 gebruikt om eilandjes van ander rest weefsel8,11te zuiveren. De geoogste eilandjes kunnen worden gekweekt in complete RPMI-1640-media, of rechtstreeks worden gebruikt in RNA/eiwit quantitatie.
Ons protocol, met behulp van een combinatie van Collagenase P spijsvertering en een enkele gradiënt zuivering stap, is eenvoudiger dan andere gepubliceerde protocollen. Onze methode vereist geen veeleisende chirurgische procedures en heeft slechts een paar eenvoudige stappen. Wat nog belangrijker is, dit protocol produceert consequent een goede opbrengst van hoogwaardige functionele eilandjes (250-350/muis) zoals we gemeld12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol omvat Collagenase perfusie en spijsvertering, gevolgd door zuivering van eilandjes. De meest kritieke stappen van dit protocol zijn effectieve injectie en volledige perfusie van de alvleesklier1,4,7. De leveringsmethode van dit protocol kan het enzym de anatomische routes doorkruisen om het exocriene weefsel rond de eilandjes1beter te verteren. Bovendien is deze techniek zeer geschikt voor vo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij zijn mevrouw Jennifer munguia zeer erkentelijk voor haar artistieke illustratie van het schematische diagram. We danken de heer Michael R. Honig in het publieke radio station van Houston, KPFT, voor zijn redactionele hulp. Deze studie werd gesteund door American Diabetes Association #1 -15-BS-177 (YS), en NIH R56DK118334/R01DK118334 (YS). Dit werk werd ook gesteund door het USDA National Institute of Food and Agriculture, Hatch project 1010840 (YS) en R01 DK095118 (SG).
Materials
| 3 mL syringe | BD | 309657 | Hoding collagenase P |
| Coverglass forceps | VWR | 82027-396 | Holding skin of mouse to aid incision procedure |
| Curved forceps | Sigma-Aldrich | Z168696 | Holding tissues during pancreas removal |
| Isoflurane | Piramal | B13B16A | To anaesthetize mice prior surgery |
| 100 mm petri dishes | VWR | 30-2041 | Used for islet culture |
| 30 G. ½ inch needle | BD | 305106 | For penetration of Ampulla of vater to deliver Collagenase P – this guage is used as it fits well in most CBDs |
| 50ml tube | VWR | 89039-658 | Holding digested pancreatic tissue, collagenase P, and purified islets |
| Absorbent pads with waterproof moisture barrier | VWR | 82020-845 | To absorb blood from syurgical procesdudes |
| Centrifuge 5810R with swing bucket and deceleration capability | Eppendorf | 5811FJ478114 | Use for pelleting tissues, pellet is formed at bottom of conical tube – swing bucket centrifuge is needed. Also the decelaration feature is important to form the gradient layers. |
| Collagenase P- 1g | Roche Diagnostics | 11249002001 | For digestion of exocrine pancreas |
| Curved surgical scissors | Fisher-Scientific | 13-804-21 | For cutting open mouse abdomen |
| Dissection microscope | Olympus | SZX16 | Used for identification of key anatomical structures to accurately deliver collagenase into pancreas |
| Hank's Balanced Salt Solution 10x | Corning | 20-023-CV | Washing cells |
| Histopaque-1077 | Sigma | RNBF5100 | For gradient formation |
| Light source | Leeds | LR92240 | Enhancing visibility of microscope |
| RNaseZap | Fisher-Scientific | AM9780 | For removing RNase |
| RPMI-1640 Media w/o L-Glutamine | Corning | 15-040-CV | Culturing Islets |
| Schwartz micro serrefines (Microvascular clamp) | Fine Science Tools | 18052-01 | Clamping common bile duct and hepatic artery |
| Shaking waterbath | Boekel/Grant | 8R0534008 | Important for mechanical digestion of exocrine tissue |
| Small surgical scissors | VWR | 82027-578 | Cuttitng tissue that atached to pancreas |
References
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biological Procedures Online. 11, 3-31 (2009).
- Gotoh, M., Maki, T., Kiyoizumi, T., Satomi, S., Monaco, A. An improved method for isolation of mouse pancreatic islets. Transplantation. 40 (4), 437-438 (1985).
- O’Dowd, J. F. The isolation and purification of rodent pancreatic islets of Langerhans. Methods in Molecular Biology. 560, 37-42 (2009).
- Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (99), e52632 (2015).
- Stull, N. D., Breite, A., McCarthy, R., Tersey, S. A., Mirmira, R. G. Mouse islet of Langerhans isolation using a combination of purified collagenase and neutral protease. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (67), (2012).
- Wang, X. Regional Differences in Islet Distribution in the Human Pancreas – Preferential Beta-Cell Loss in the Head Region in Patients with Type 2 Diabetes. PLOS ONE. 8, (2013).
- Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nature Protocols. 4 (11), 1649-1652 (2009).
- Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (88), e50374 (2014).
- Scharp, D. W., Lacy, P. E., Finke, E., Olack, B. Low-temperature culture of human islets isolated by the distention method and purified with Ficoll or Percoll gradients. Surgery. 107 (5), e50374 (1987).
- Salvalaggio, P. R. Islet filtration: a simple and rapid new purification procedure that avoids ficoll and improves islet mass and function. Transplantation. 74 (66), 877-879 (2002).
- Saliba, Y., Bakhos, J. J., Itani, T., Fares, N. An optimized protocol for purification of functional islets of Langerhans. Laboratory Investigation. 97 (1), 70-83 (2017).
- Pradhan, G., et al. Obestatin stimulates glucose-induced insulin secretion through ghrelin receptor GHS-R. Scientific Reports. 7 (1), 979 (2017).
- Shapiro, A. M. J., Hao, E., Rajotte, R. V., Kneteman, N. M. High yield of rodent islets with intraductal collagenase and stationary digestion–a comparison with standard technique. Cell Transplantation. 5 (6), 631-638 (1996).
