En enkel High Efficiency Protocol for bukspyttkjertelen Islet Isolation fra mus
Summary
Dette Holme isolasjons protokollen beskrev en roman rute av kollagenase injeksjon å fordøye eksokrin vev og en forenklet gradient prosedyre for å rense holmer fra mus. Det innebærer enzymatisk fordøyelse, gradient separasjon/rensing, og Holme hånd-plukking. Vellykket isolering kan gi 250 – 350 høy kvalitet og fullt funksjonelle holmer per mus.
Abstract
Bukspyttkjertelen holmer, også kalt holmer Langerhans, er en klynge av endokrine celler som produserer hormoner for glukose regulering og andre viktige biologiske funksjoner. Holmer består hovedsakelig av fem typer hormon-sekresjon celler: α celler skiller glukagon, β celler skiller ut insulin, δ celler skiller somatostatin, ε celler skiller ghrelin, og PP celler skiller bukspyttkjertelen polypeptid. 60 til 80% av cellene i holmer er β-celler, som er den viktigste cellen befolkning å studere insulin sekresjon. Bukspyttkjertelen holmer er et avgjørende modell system for å studere ex vivo insulin sekresjon. Anskaffe høy kvalitet holmer er av stor betydning for diabetes forskning. De fleste Holme isolasjon prosedyrer krever teknisk vanskelig å få tilgang til stedet for kollagenase injeksjon, harde og komplekse fordøyelsen prosedyrer, og flere tetthet gradient rensing trinn. Dette papiret har en enkel High Yield Mouse Holme isolasjon metode med detaljerte beskrivelser og realistiske demonstrasjoner, som viser følgende konkrete skritt: 1) injeksjon av kollagenase P ved ampulle av Vater, et lite område som ble med i bukspyttkjertelen duct og den vanlige galle duct, 2) enzymatisk fordøyelse og mekanisk separasjon av eksokrin bukspyttkjertel, og 3) en enkelt gradient rensing trinn. Fordelene med denne metoden er injeksjon av fordøyelsesenzymer ved hjelp av mer tilgjengelig ampulle av Vater, mer komplett fordøyelse ved hjelp av kombinasjon av enzymatisk og mekaniske tilnærminger, og en enklere enkelt gradient rensing trinn. Denne protokollen produserer ca. 250 – 350 holmer per mus. og holmer er egnet for ulike ex vivo-studier. Mulige begrensninger i denne prosedyren er potensielt skadede holmer på grunn av enzymatisk fordøyelse og/eller forlenget gradient inkubasjons, som alle kan i stor grad unngås ved forsiktig annonse begrunnelse av inkubasjonstid.
Introduction
Det er to vanlige metoder i litteraturen for bukspyttkjertel-Holmen isolasjon. Man krever excising bukspyttkjertelen og dicing den i små biter ved hjelp av kirurgisk saks, og deretter fordøye det i en kollagenase løsning1,2,3. En annen mer presis metode er å bruke nettverket av kanaler til stede i bukspyttkjertelen for å innføre fordøyelsesenzymer. Følgende områder har blitt brukt for fordøyelsesenzymer injeksjon: krysset av galle og cystisk duct, galleblæren til felles galle duct, eller vanlig galle duct seg1,4,5. Det er kjent at holmer ikke fordeles jevnt i bukspyttkjertelen; den milt regionen inneholder de fleste holmer6. Mens den andre metoden ved hjelp av anatomiske ruter for å levere fordøyelsesenzymer gir en mer fullstendig behandling av bukspyttkjertelen, inkludert milt regionen, krever denne prosedyren ofte klemmer eller suturing av ampulle av Vater som er teknisk Utfordrende. I form av Holme rensing, flere tetthet graderinger, samt celle siler og magnetisk tilbaketrekking har blitt brukt til å rense holmer3,7. Utnyttelsen av disse gradienter kan være tidkrevende og Ficoll graderinger kan føre til giftige skader av holmer8.
Den gjeldende protokollen er bygget på metoden beskrevet av Li et al.7, med ytterligere modifikasjoner lagt til basert på erfaringene fra oss selv og andre1,4. De mest kritiske trinnene i vår protokoll er klemmer av felles galle duct nær leveren slutten, sprøytebruk kollagenase P via ampulle av Vater å fordøye eksokrin vev, og deretter bruke en risting vannbad å fremskynde fordøyelsen mekanisk1, 4,7. Deretter brukes en “STOP”-løsning for å hemme ytterligere fordøyelse av holmer; HBSS brukes til å vaske av gjenværende kollagenase P og STOP-løsning. Da Ficoll-metoden ble brukt til å rense menneske holmer, ble det rapportert at det var dobbelt så mange holmer med større funksjonell kapasitet (f.eks. insulin sekresjon) sammenlignet med bruken av Percoll graderinger9. Men studier har stilt spørsmål ved bruk av Ficoll gradient på grunn av sin giftige effekt på holmer1,10. Det har blitt rapportert at Histopaque gradient gir optimal rensing Kinetics for mus Holmen isolasjon, noe som gir god avkastning av høy kvalitet holmer med enklere trinn og lavere kostnad1. I vår protokoll, Histopaque-1077 brukes til å rense holmer fra andre rester av vev8,11. De høstes holmer kan være kultivert i komplett RPMI-1640 Media, eller direkte benyttet i RNA/protein kvantifisering.
Vår protokoll, ved hjelp av en kombinasjon av kollagenase P fordøyelsen og en enkelt gradient rensing trinn, er enklere enn andre publiserte protokoller. Vår metode krever ikke krevende kirurgiske prosedyrer og har bare noen få enkle trinn. Enda viktigere, gir denne protokollen konsekvent en god avkastning av høy kvalitet funksjonelle holmer (250-350/mus) som vi rapporterte12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen inkluderer kollagenase og fordøyelse, etterfulgt av rensing av holmer. De mest kritiske trinnene i denne protokollen er effektiv injeksjon og fullstendig mengde av bukspyttkjertelen1,4,7. Leveringsmetoden for denne protokollen gjør at enzymet å krysse anatomiske ruter for å bedre fordøye eksokrin vevet rundt holmer1. I tillegg er denne teknikken velegnet for fullstendig fordøyelse …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er svært takknemlige for fru Jennifer Munguia for hennes kunstneriske illustrasjon av skjematisk diagram. Vi takker Mr. Michael R. Honig på Houston ‘ s Community Public Radio Station KPFT for hans redaksjonelle assistanse. Denne studien ble støttet av American Diabetes Association #1 -15-BS-177 (andre), og NIH R56DK118334/R01DK118334 (andre). Dette arbeidet ble også støttet av USDA National Institute of Food and Agriculture, Hatch prosjekt 1010840 (/) og R01 DK095118 (SG).
Materials
| 3 mL syringe | BD | 309657 | Hoding collagenase P |
| Coverglass forceps | VWR | 82027-396 | Holding skin of mouse to aid incision procedure |
| Curved forceps | Sigma-Aldrich | Z168696 | Holding tissues during pancreas removal |
| Isoflurane | Piramal | B13B16A | To anaesthetize mice prior surgery |
| 100 mm petri dishes | VWR | 30-2041 | Used for islet culture |
| 30 G. ½ inch needle | BD | 305106 | For penetration of Ampulla of vater to deliver Collagenase P – this guage is used as it fits well in most CBDs |
| 50ml tube | VWR | 89039-658 | Holding digested pancreatic tissue, collagenase P, and purified islets |
| Absorbent pads with waterproof moisture barrier | VWR | 82020-845 | To absorb blood from syurgical procesdudes |
| Centrifuge 5810R with swing bucket and deceleration capability | Eppendorf | 5811FJ478114 | Use for pelleting tissues, pellet is formed at bottom of conical tube – swing bucket centrifuge is needed. Also the decelaration feature is important to form the gradient layers. |
| Collagenase P- 1g | Roche Diagnostics | 11249002001 | For digestion of exocrine pancreas |
| Curved surgical scissors | Fisher-Scientific | 13-804-21 | For cutting open mouse abdomen |
| Dissection microscope | Olympus | SZX16 | Used for identification of key anatomical structures to accurately deliver collagenase into pancreas |
| Hank's Balanced Salt Solution 10x | Corning | 20-023-CV | Washing cells |
| Histopaque-1077 | Sigma | RNBF5100 | For gradient formation |
| Light source | Leeds | LR92240 | Enhancing visibility of microscope |
| RNaseZap | Fisher-Scientific | AM9780 | For removing RNase |
| RPMI-1640 Media w/o L-Glutamine | Corning | 15-040-CV | Culturing Islets |
| Schwartz micro serrefines (Microvascular clamp) | Fine Science Tools | 18052-01 | Clamping common bile duct and hepatic artery |
| Shaking waterbath | Boekel/Grant | 8R0534008 | Important for mechanical digestion of exocrine tissue |
| Small surgical scissors | VWR | 82027-578 | Cuttitng tissue that atached to pancreas |
References
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biological Procedures Online. 11, 3-31 (2009).
- Gotoh, M., Maki, T., Kiyoizumi, T., Satomi, S., Monaco, A. An improved method for isolation of mouse pancreatic islets. Transplantation. 40 (4), 437-438 (1985).
- O’Dowd, J. F. The isolation and purification of rodent pancreatic islets of Langerhans. Methods in Molecular Biology. 560, 37-42 (2009).
- Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (99), e52632 (2015).
- Stull, N. D., Breite, A., McCarthy, R., Tersey, S. A., Mirmira, R. G. Mouse islet of Langerhans isolation using a combination of purified collagenase and neutral protease. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (67), (2012).
- Wang, X. Regional Differences in Islet Distribution in the Human Pancreas – Preferential Beta-Cell Loss in the Head Region in Patients with Type 2 Diabetes. PLOS ONE. 8, (2013).
- Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nature Protocols. 4 (11), 1649-1652 (2009).
- Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (88), e50374 (2014).
- Scharp, D. W., Lacy, P. E., Finke, E., Olack, B. Low-temperature culture of human islets isolated by the distention method and purified with Ficoll or Percoll gradients. Surgery. 107 (5), e50374 (1987).
- Salvalaggio, P. R. Islet filtration: a simple and rapid new purification procedure that avoids ficoll and improves islet mass and function. Transplantation. 74 (66), 877-879 (2002).
- Saliba, Y., Bakhos, J. J., Itani, T., Fares, N. An optimized protocol for purification of functional islets of Langerhans. Laboratory Investigation. 97 (1), 70-83 (2017).
- Pradhan, G., et al. Obestatin stimulates glucose-induced insulin secretion through ghrelin receptor GHS-R. Scientific Reports. 7 (1), 979 (2017).
- Shapiro, A. M. J., Hao, E., Rajotte, R. V., Kneteman, N. M. High yield of rodent islets with intraductal collagenase and stationary digestion–a comparison with standard technique. Cell Transplantation. 5 (6), 631-638 (1996).
