En enkel hög verkningsgrad protokoll för bukspottskörteln ö isolering från möss
Summary
Detta ö-isolerings protokoll beskrev en ny väg av kollagenasinjektion för att smälta den exokrina vävnaden och en förenklad gradient förfarande för att rena kobbar från möss. Det handlar om enzymatisk matsmältning, gradient separation/rening, och Islet handplockning. Lyckad isolering kan ge 250 – 350 hög kvalitet och fullt fungerande öar per mus.
Abstract
Pankreasöarna, även kallade Langerhanska öar, är ett kluster av endokrina celler som producerar hormoner för glukos reglering och andra viktiga biologiska funktioner. Kobbar består främst av fem typer av hormonutsöndra celler: α-celler utsöndrar glukagon, β-celler utsöndrar insulin, δ-celler utsöndrar somatostatin, ε-celler utsöndrar ghrelin och PP-celler utsöndrar pankreaspolypeptid. 60 till 80% av cellerna i kobbar är β-celler, som är den viktigaste cellpopulationen för att studera insulinsekretion. Pankreasöar är ett viktigt modellsystem för att studera ex vivo insulinsekretion. Att förvärva högkvalitativa öar är av stor betydelse för diabetesforskningen. De flesta ö isolering förfaranden kräver tekniskt svårt att få tillgång till platsen för kollagenase injektion, hårda och komplexa rötning förfaranden, och flera densitet lutning rening steg. Detta papper har en enkel hög avkastning mus ö isolering metod med detaljerade beskrivningar och realistiska demonstrationer, som visar följande specifika steg: 1) injektion av kollagenas P vid ampulla av Vater, ett litet område som förbinder bukspottskörteln kanalen och den gemensamma gallgången, 2) enzymatisk matsmältning och mekanisk separation av exokrina bukspottkörteln, och 3) en enda gradient reningssteg. Fördelarna med denna metod är injektion av matsmältnings enzym med hjälp av mer tillgängliga ampulla av Vater, mer fullständig matsmältning med kombinationen av enzymatiska och mekaniska metoder, och en enklare enkelgradient rening steg. Detta protokoll producerar cirka 250 — 350 öar per mus; och holvar lämpar sig för olika ex vivo-studier. Möjliga förbehåll för detta förfarande är potentiellt skadade öar på grund av enzymatisk matsmältning och/eller långvarig gradient inkubation, som alla kan i stort sett undvikas genom noggrann annons motivering av inkubationstiden.
Introduction
Det finns två vanliga metoder i litteraturen för bukspottskörteln ö isolering. Man kräver excising bukspottkörteln och tärning det i små bitar med hjälp av kirurgisk sax, och sedan smälta det i en kollagenase lösning1,2,3. En annan mer exakt metod är att använda nätverket av kanaler som finns i bukspottkörteln att införa matsmältningsorganen enzym. Följande platser har använts för mag enzym injektion: korsningen av galla och cystisk kanal, gallblåsan i gallgången, eller den gemensamma gallgången själv1,4,5. Det är känt att holnor inte är jämnt fördelade i bukspottkörteln; mjälten regionen innehåller de mest öar6. Medan den andra metoden med anatomiska vägar för att leverera matsmältningsenzymer möjliggör en mer komplett perfusion av bukspottkörteln, inklusive mjälten regionen, detta förfarande kräver ofta fastspänning eller suturering av ampulla av Vater som är tekniskt Utmanande. När det gäller ö rening, flera densitet gradienter, samt cell silar och magnetisk retraktion har använts för att rena öarna3,7. Utnyttjandet av dessa gradienter kan vara tidskrävande och Ficoll gradienter kan resultera i giftiga skador av öar8.
Det nuvarande protokollet bygger på den metod som beskrivs av Li et al.7, med ytterligare modifieringar som läggs till baserat på upplevelsen av oss självaoch andra1,4. De mest kritiska stegen i vårt protokoll är fastspänning av den gemensamma gallgången nära levern slutet, injicera kollagenase P via ampulla av Vater att smälta den exokrina vävnaden, och sedan använda en skakning vattenbad att påskynda matsmältningen mekaniskt1, 4,7. Därefter används en “stopplösning” för att hämma ytterligare nedbrytning av kobbar. HBSS används för att tvätta bort kvarvarande kollagenase P-och stopplösning. När Ficoll-metoden användes för att rena humana öar rapporterades avkastningen vara dubbelt så stor som holarna med större funktionell förmåga (t. ex. insulinsekretion) jämfört med användning av Percoll-lutningar9. Studier har dock ifrågasatt användningen av Ficoll gradient på grund av dess toxiska effekt på holmar1,10. Det har rapporterats att Histopaque gradient ger optimal rening kinetik för mus ö-isolering, som ger god avkastning av högkvalitativa öar med enklare steg och lägre kostnad1. I vårt protokoll används Histopaque-1077 för att rena öar från annan kvarvarande vävnad8,11. De skördade holarna kan odlas i komplett RPMI-1640 media, eller direkt utnyttjas i RNA/proteinkvantifiering.
Vårt protokoll, med hjälp av en kombination av kollagenase P matsmältningen och en enda gradient reningssteg, är enklare än andra publicerade protokoll. Vår metod kräver inte krävande kirurgiska ingrepp och har bara några enkla steg. Ännu viktigare är att detta protokoll konsekvent ger en bra avkastning av hög kvalitet funktionella öar (250-350/mus) som vi rapporterade12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll omfattar kollagenas perfusion och matsmältning, följt av rening av kobbar. De mest kritiska stegen i detta protokoll är effektiv injektion och fullständig perfusion av bukspottkörteln1,4,7. Leveransmetoden för detta protokoll tillåter enzymet att korsa de anatomiska rutterna för att bättre smälta den exokrina vävnaden som omger holmar1. Dessutom är denna teknik väl lämpad fö…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är oerhört tacksamma mot MS Jennifer Munguia för hennes konstnärliga illustration av det schematiska diagrammet. Vi tackar Mr Michael R. Honig på Houstons community Public Radio Station KPFT för hans redaktionella hjälp. Denna studie stöddes av American Diabetes Association #1 -15-BS-177 (YS), och NIH R56DK118334/R01DK118334 (YS). Detta arbete stöddes också av USDA nationella institutet för livsmedel och jordbruk, Hatch projekt 1010840 (YS) och R01 DK095118 (SG).
Materials
| 3 mL syringe | BD | 309657 | Hoding collagenase P |
| Coverglass forceps | VWR | 82027-396 | Holding skin of mouse to aid incision procedure |
| Curved forceps | Sigma-Aldrich | Z168696 | Holding tissues during pancreas removal |
| Isoflurane | Piramal | B13B16A | To anaesthetize mice prior surgery |
| 100 mm petri dishes | VWR | 30-2041 | Used for islet culture |
| 30 G. ½ inch needle | BD | 305106 | For penetration of Ampulla of vater to deliver Collagenase P – this guage is used as it fits well in most CBDs |
| 50ml tube | VWR | 89039-658 | Holding digested pancreatic tissue, collagenase P, and purified islets |
| Absorbent pads with waterproof moisture barrier | VWR | 82020-845 | To absorb blood from syurgical procesdudes |
| Centrifuge 5810R with swing bucket and deceleration capability | Eppendorf | 5811FJ478114 | Use for pelleting tissues, pellet is formed at bottom of conical tube – swing bucket centrifuge is needed. Also the decelaration feature is important to form the gradient layers. |
| Collagenase P- 1g | Roche Diagnostics | 11249002001 | For digestion of exocrine pancreas |
| Curved surgical scissors | Fisher-Scientific | 13-804-21 | For cutting open mouse abdomen |
| Dissection microscope | Olympus | SZX16 | Used for identification of key anatomical structures to accurately deliver collagenase into pancreas |
| Hank's Balanced Salt Solution 10x | Corning | 20-023-CV | Washing cells |
| Histopaque-1077 | Sigma | RNBF5100 | For gradient formation |
| Light source | Leeds | LR92240 | Enhancing visibility of microscope |
| RNaseZap | Fisher-Scientific | AM9780 | For removing RNase |
| RPMI-1640 Media w/o L-Glutamine | Corning | 15-040-CV | Culturing Islets |
| Schwartz micro serrefines (Microvascular clamp) | Fine Science Tools | 18052-01 | Clamping common bile duct and hepatic artery |
| Shaking waterbath | Boekel/Grant | 8R0534008 | Important for mechanical digestion of exocrine tissue |
| Small surgical scissors | VWR | 82027-578 | Cuttitng tissue that atached to pancreas |
References
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biological Procedures Online. 11, 3-31 (2009).
- Gotoh, M., Maki, T., Kiyoizumi, T., Satomi, S., Monaco, A. An improved method for isolation of mouse pancreatic islets. Transplantation. 40 (4), 437-438 (1985).
- O’Dowd, J. F. The isolation and purification of rodent pancreatic islets of Langerhans. Methods in Molecular Biology. 560, 37-42 (2009).
- Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (99), e52632 (2015).
- Stull, N. D., Breite, A., McCarthy, R., Tersey, S. A., Mirmira, R. G. Mouse islet of Langerhans isolation using a combination of purified collagenase and neutral protease. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (67), (2012).
- Wang, X. Regional Differences in Islet Distribution in the Human Pancreas – Preferential Beta-Cell Loss in the Head Region in Patients with Type 2 Diabetes. PLOS ONE. 8, (2013).
- Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nature Protocols. 4 (11), 1649-1652 (2009).
- Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (88), e50374 (2014).
- Scharp, D. W., Lacy, P. E., Finke, E., Olack, B. Low-temperature culture of human islets isolated by the distention method and purified with Ficoll or Percoll gradients. Surgery. 107 (5), e50374 (1987).
- Salvalaggio, P. R. Islet filtration: a simple and rapid new purification procedure that avoids ficoll and improves islet mass and function. Transplantation. 74 (66), 877-879 (2002).
- Saliba, Y., Bakhos, J. J., Itani, T., Fares, N. An optimized protocol for purification of functional islets of Langerhans. Laboratory Investigation. 97 (1), 70-83 (2017).
- Pradhan, G., et al. Obestatin stimulates glucose-induced insulin secretion through ghrelin receptor GHS-R. Scientific Reports. 7 (1), 979 (2017).
- Shapiro, A. M. J., Hao, E., Rajotte, R. V., Kneteman, N. M. High yield of rodent islets with intraductal collagenase and stationary digestion–a comparison with standard technique. Cell Transplantation. 5 (6), 631-638 (1996).
