多重等温増幅ベース ジカ、チクングニア ウイルスおよびデング熱 1 を検出する診断プラットフォーム
Summary
現在では、複雑なサンプル準備と高価な計測器が必要し、低リソース環境では使用しにくいジカ、チクングニア ウイルスおよびデング ウイルスを検出する診断機能を多重化します。ターゲット固有の鎖移動できるプローブと等温増幅を使用して検出し、高い感度と特異性を持つこれらのウイルスを区別する診断を示します。
Abstract
ジカ、デング熱、チクングニヤ ウイルスは、同様の患者の症状を病気の原因、蚊によって送信されます。しかし、異なる下流患者 – 伝送ポテンシャルがある、非常に異なる患者さんの治療を必要とします。したがって、最近のジカの発生は急速に患者でこれらのウイルスを区別するツールの開発が急務し、閉じ込められた蚊は、正しい患者の治療を選択し理解し、リアルタイムで彼らの疫学を管理します。
残念ながら、それらの受信 2016年の緊急電話を含む現在の診断テスト承認を使用、ファーストトラックの状態、計測を必要とする逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR) によるウイルス RNA 訓練、ユーザーを検出し、かなりサンプル準備。したがって、彼らは時間を必要とする「承認」参照研究所に送られなければなりません。確かに、2016 年 8 月に (CDC) 疾病対策センターを求めていた妊娠中の女性いた蚊に噛まれ、感染しているかどうか、学習する前に受け入れの 2 〜 4 週間を待たなければジカを示す発疹を開発しました。我々 は非常にテスト サイト、いくつかのリソースと訓練を受けたが、必ずしも認可されなかった者にすることができる必要があります。
このビデオは、多くのサンプルの準備もすべて分析 (環境調査) の押しつぶされた蚊の死体 (患者) のための血清または尿の使用、これらの仕様を満たしていることを示します。蚊の死骸は、第四級アンモニウム (Q 紙) アンモニア処理順を管理するグループ石綿を運ぶ紙にキャプチャされます。これら直接 RNA 分離せずに入れているアッセイ チューブ冷凍のチェーンを必要としない凍結乾燥試薬を含みます。逆のトランスクリプション ループ lamp 法ターゲット固有蛍光タグ移動できるプローブとの変更されたフォームは、3 色の蛍光信号として 30 分内の読み出しを生成します。これはオレンジ色のフィルターを持つハンドヘルド、バッテリ駆動のデバイスで可視化します。シール チューブ不耐熱ウラシル DNA グリコシラーゼ (UDG) dUTP 増幅混合物の存在下での使用と前方の汚染は防がれます。
Introduction
蚊媒介性ウイルス感染症、デング熱、チクングニア、ジカ ウイルスなどは上昇と需要の即時管理戦略では。デング熱とチクングニア ウイルスがすでにジカは西半球に1で広がって熱帯地域の多くで流行。ジカ、デング熱のようなフラビ家族のメンバーである、1 つのアジアと 2 つのアフリカの遺伝的系統2アフリカ原産。ジカ ウイルスの同定は 1947 年にさかのぼる、にもかかわらず人間のジカ感染散発的な太平洋とアメリカ大陸に出現する前に、の半世紀のために残った。2007 年、ミクロネシアのヤップ島に発生した熱ジカの最初の報告された発生は続いてフランス領ポリネシア、2013、2014アメリカの最初の主要な発生は、2015 年にブラジルで発生しました。
ジカ、チクングニア ウイルスおよびデング ウイルスは、主にネッタイシマカとヒトスジシマカによって送信されます。しかしジカ母-胎児の相互作用、性的接触を介して、授乳3,4,5を介して可能性が広がっている、追加下流ヒト-ヒト感染の可能性があります。ジカ熱は、最初唯一の軽度の病気を引き起こすと考えられていた。しかし、それは後で大人のギランバレー症候群、新生児、および最後の月への年を可能性があります慢性の筋骨格系疾患の小頭症に関連付けられています。ジカの感染症の症状は他のウイルスの蚊拡散6に似ているので、ジカの病気の診断に挑戦することができます。これらのウイルスの一般的な共同感染は、鑑別診断もより挑戦的な7,8を作る。したがって、コントロールと予防措置を開始し、患者のケア9を管理する、リアルタイムで疫学を理解するからジカと他のウイルス核酸の迅速かつ信頼性の高い検出が必要です。
これらのウイルスの現在の診断テストには、血清学的検査、ウイルス分離、ウイルス シーケンシング、および逆転写 PCR (RT-PCR) が含まれます。標準的な血清学的手法がしばしば不十分な感度に苦しんで、結果以前他の発現によって感染している患者での交差反応性によって複雑になることができます。
したがって、核酸テストを検出し、これらのウイルスを区別する最も信頼性の高い方法になります。ジカと他蚊媒介ウイルスの検出が通常、RT-PCR 法やリアルタイム RT-PCR 体液、血清、尿、唾液、精液、母乳、脳液10,11などの様々 なを使用して実行されます。彼らは以下の PCR 阻害、高ウイルス量、長期間とコレクションと12,13を処理の簡易化のためのウイルスの存在を示すので、尿および唾液のサンプルは、血液より一般に優先されます。RT-PCR ベースの診断テストは、ただし、広範なサンプル準備のステップと少ないポイント ・ オブ ・ ケアなどに最適、高価な熱サイクリング機器を構成します。
逆のトランスクリプション ループ lamp 法 (RT ランプ) は、その高い感度と特異性14のための強力な RT-PCR の代替として登場した、生物の阻害物質のための許容のサンプル15、大幅削減分析複雑さとコスト、低い資源の環境に適している単一の温度の操作。RT ランプ、クラシックで実装されている、6 種類のプライマー RNA ターゲット内で 8 つの異なる領域にバインドで構成されます。60 ° C 〜 70 ° C の一定温度で実行して強い鎖置換活性と逆転写酵素と DNA ポリメラーゼを使用しています。
RT ランプの初期段階では、前方と後方内部プライマー (FIP と BIP、図 1 a) 外側前方と後方のプライマー (F3 と B3) と一緒にはダンベル構造、ランプの指数関数的増幅の種子構造を形成します。増幅はループ前方と後方のプライマー (LF と LB)、ダンベルの単一の孤立した地域にバインドするように設計は、促進、複数の繰り返しのあるコンカテマーの形成の結果ループ16。クラシック ランプに基づいて濁度の試金または DNA 間の染料をインターカ レートによる読み出しは多重化のいくつかのレベルが、ジカのポイント ・ オブ ・ ケア検出希望17,18,19完全に適しています。オフのターゲット増幅による偽陽性を生成する傾向があると多重は簡単に得これらのシステムでないです。
これらの問題を管理するには、は、文学は、古典的な RT ランプ アーキテクチャ20,21,22に「鎖置換プローブ」の形で追加コンポーネントを追加します。各プローブにはシーケンス固有の二重鎖領域と一本鎖プライミング領域。一本鎖領域にプローブが付いている 5′-fluorophore と 3′ 末端クェンチャーで相補的プローブを変更します。ターゲットがない場合は、近くに fluorophore とクエンチャをもたらす相補的プローブ ストランドの交配による蛍光は認められなかった。ターゲットの存在下で蛍光プローブの一本鎖部分はターゲットの補数にバインドし、変位ポリメラーゼ鎖によっては拡張されます。逆のプライマーによってさらにポリメラーゼ伸張蛍光(図 1 b)の排出量をできるように、その相補的な蛍光に分類されたストランドからクェンチャー鎖の分離を原因します。この設計では、誤検知信号の可能性を減らすこと、ダンベル形成後信号が生成されます。
鎖置換プローブの二重鎖の部分は、任意のシーケンスをすることができ、多重化が適用されると、同じシーケンスが使用異なる fluorophore クェンチャーのペア。このアーキテクチャやウイルスに汚染された尿、血清、蚊にサンプル紙に踏み付け直接試験サンプル準備なしに導入されました。30-45 分以内で生成された人間の目に目に見える三色の蛍光進み、信号が青色 LED とオレンジ色のフィルターを使用して、3 D プリントされた観測ボックスによって想像されたもの。RT ランプ試薬を凍結乾燥、冷凍を必要としないリソース設定を下げるキットの展開が有効になっています。
Protocol
Representative Results
Discussion
ジカ、チクングニア、デング熱などの蚊媒介ウイルスは、低コストのポイント ・ オブ ・ ケア検出選択肢蚊サーベイランスのためだけでなく、患者の診断のための必要性公衆衛生と最近ジカ発生ハイライトを脅かします。等温増幅法は、PCR ベースのシステムを手頃な価格の代替として開発されました。特に、RT ランプ ベースのプラットフォームは、幅広い病原体の検出に適用されています?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
仕事は、FDOH 7ZK15、NIAID 1R21AI128188-01 によって部分的に支えられました。この出版物で報告された研究は、国立研究所のアレルギーと感染症、一部生物医学研究プログラムのフロリダ保健省によって部分で支えられました。内容は著者の責任と NIH やフロリダ保健省の公式見解を必ずしも表さない。動的コンビナトリアル化学 LLC は彼らのサポートおよびこのプロジェクトへの貢献を認めています。
1 デング熱ウイルス (ひずみボル KW010) は親切でフロリダ部の健康局の研究所を提供します。ジカとチクングニア ウイルスのアジア家系は、疾病管理・予防センターに提供された優雅。チクングニア ウイルスのインド洋系統親切ロバート ・ テッシュ (新興ウイルスやテキサス大学医学部ガルベストン、テキサス州からのアルボ ウイルス世界参照センター) から UF FMEL に提供されました。感染症研究の支援、s. ベラミー、B. ・ イーストモンド、s. オルティス、+ ベレス、k. ウィギンス、r. ZimLer と克ザーベルに感謝します。我々 はまた、Q 紙を提供するため m. s. キムを感謝します。
Materials
| SafeBlue Illuminator/ Electrophoresis System, MBE-150-PLUS | Major Science | MBE-150 | Gel electrophoresis |
| G:BOX F3 | Syngene | G:BOX F3 | Gel imaging |
| LightCycler 480 Instrument II, 96-well | Roche Applied Science | 05 015 278 001 | Real-time PCR |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | Millipore Sigma | UFC501096 | ultrafiltraton membrane for dialysis |
| Eppendorf 5417C Centrifuge | Marshall Scientific | EP-5417C | centrifuge |
| Myblock Mini Drybath | Benchmark Scientific | BSH200 | drybath |
| FreeZone Plus 6 Liter Cascade Console Freeze Dry System | Labconco | 7934020 | lyophilizer |
| all priers and probes | IDT | custom | RT-LAMP primers and probes |
| dNTP set | Bioline | BIO-39049 | |
| Deoxyuridine Triphosphate (dUTP) | Promega | U1191 | |
| Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase | New England Biolabs | M0538L | enzyme |
| WarmStart RTx Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0380L | enzyme |
| RNase Inhibitor, Murine | New England Biolabs | M0314L | enzyme |
| Antarctic Thermolabile UDG | New England Biolabs | M0372L | enzyme |
| 50bp DNA Step Ladder | Promega | G4521 | marker |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche Applied Science | 4729692001 | real-time RT-LAMP analysis |
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