La amplificación isotérmica multiplexada basado en plataforma de diagnóstico para detectar Zika, Chikungunya y Dengue 1
Summary
Corriente de multiplexado de diagnóstico para detectar los Zika, chikungunya y dengue virus requieren preparación compleja y costosa instrumentación y son difíciles de usar en entornos de bajos recursos. Se muestra un diagnóstico que utiliza amplificación isotérmica con sondas desplazable filamento blanco específico para detectar y diferenciar estos virus con alta sensibilidad y especificidad.
Abstract
Zika, el dengue y el chikungunya virus son transmitidos por mosquitos, que causan enfermedades con sintomatología similar. Sin embargo, tienen potencialidades diferentes aguas abajo transmisión de paciente a paciente y requieren tratamientos de pacientes muy diferentes. Así, los brotes recientes de Zika hacen urgente a desarrollar herramientas que discriminan rápidamente estos virus en pacientes y atrapados los mosquitos, el correcto tratamiento de los pacientes y para comprender y manejar su epidemiología en tiempo real.
Desafortunadamente, pruebas de diagnóstico actuales, incluyendo ésos emergencia de 2016 recibe autorizaciones de uso y rápido estado, detectar ARN viral por transcripción reversa reacción en cadena polimerasa (RT-PCR), que requiere instrumentación, formación usuarios, y preparación de la muestra considerable. Por lo tanto, deben enviarse a laboratorios de referencia “aprobado”, que requiere tiempo. De hecho, en agosto de 2016, el centro para el Control de enfermedades (CDC) estaba pidiendo que las mujeres embarazadas que había sido mordido por un mosquito y desarrolló una erupción de Zika indicando esperar un inaceptable 2 a 4 semanas antes del aprendizaje si estaban infectados. Mucho necesitamos pruebas que se pueden realizar en sitio, con pocos recursos y por personal entrenado pero no necesariamente con licencia.
Este video muestra un ensayo que cumpla con estas especificaciones, trabajando con orina o suero (para pacientes) o cadáveres de mosquitos aplastados (para la vigilancia ambiental), sin mucha preparación de la muestra. Cadáveres de mosquitos son capturados en papel con amonio cuaternario grupos (Q-papel) seguidos por el tratamiento de amoníaco para la gestión de riesgos biológicos. Estos son entonces directamente, sin el aislamiento de RNA, puestos en tubos de ensayo con reactivos liofilizados que ninguna cadena de refrigeración. Una forma modificada de amplificación isotérmica mediada lazo de transcripción inversa con sondas desplazables fluorescente etiquetas específico del destino produce lectura, en el minuto 30, como una señal de la fluorescencia tricolor. Esto se visualiza con un dispositivo portátil, con pilas con un filtro naranja. Contaminación hacia adelante se previene con tubos cerrados y el uso de termolábiles uracil ADN glicosilasa (UDG) en presencia de dUTP en la mezcla de amplificación.
Introduction
Infecciones de virus transmitidos por mosquitos, incluyendo Zika virus, dengue y chikungunya son en las estrategias de manejo inmediato de aumento y la demanda. Dengue y chikungunya virus ya son endémicos en muchas de las regiones tropicales donde Zika ahora se extiende en el hemisferio occidental1. Zika virus, como el dengue, es un miembro de la familia Flaviviridae y es nativo a África con un asiático y dos linajes genéticos africanos2. A pesar de la identificación del virus Zika se remonta a 1947, Zika infección en seres humanos seguía siendo esporádica por medio siglo antes de emerger en el Pacífico y las Américas. El primer brote reportado de Zika fiebre se produjo en la isla de Yap, en los Estados federados de Micronesia en 2007, seguido de la Polinesia francesa en 2013 y 2014. El primer brote importante en las Américas ocurrió en el año 2015 en Brasil.
Zika, chikungunya y dengue virus son transmitidos principalmente por Aedes aegypti y Aedes albopictus. Sin embargo, Zika tiene posibilidades de transmisión de humano a humano adicionales aguas abajo, es probable que se propague a través del contacto sexual, interacción de la madre al feto y a través de la lactancia materna3,4,5. La fiebre Zika primero se cree que causan sólo leves. Sin embargo, más tarde fue asociada con el síndrome de Guillain-Barré en adultos, microcefalia en recién nacidos y las enfermedades musculoesqueléticas crónicas que pueden durar meses a años. Diagnóstico de enfermedad de Zika puede ser difícil, ya que los síntomas de una infección de Zika son similares a los de otros virus mosquito-extensión6. Las coinfecciones comunes de estos virus hacen diagnóstico diferencial más difícil7,8. Por lo tanto, la detección rápida y confiable de los ácidos nucleicos de Zika y otros virus es necesario para comprender la epidemiología en tiempo real, para iniciar medidas preventivas y control y para gestionar la atención de los pacientes9.
Pruebas de diagnóstico actuales para estos virus incluyen pruebas serológicas, aislamiento viral, secuenciación de virus y transcripción reversa PCR (RT-PCR). Estándar métodos serológicos a menudo sufren de sensibilidad insuficiente y resultados pueden ser complicados por reactividad cruzada en pacientes que previamente han sido infectados por otros flaviviruses.
Por lo tanto, pruebas de ácido nucleico sigue siendo la forma más confiable para detectar y diferenciar estos virus. Detección de Zika y otros virus transmitidos por mosquitos se realiza generalmente mediante RT-PCR o RT-PCR en tiempo real en gran variedad de fluidos biológicos, como suero, orina, saliva, semen, leche materna y líquido cerebral10,11. Las muestras de orina y la saliva se prefiere generalmente sobre sangre, puesto que exhiben menos inhibición de la polimerización en cadena, cargas virales más altas, presencia de virus por largos períodos de tiempo y aumento de la facilidad de recolección y manejo de12,13. Pruebas diagnósticas basadas en RT-PCR, sin embargo, conforman la muestra extenso y caro equipamiento ciclismo térmico, haciéndolo menos óptima para el punto de atención.
Muestras de su tolerancia de sustancias inhibidoras en biológico y reversa de la transcripción mediada por el bucle de amplificación isotérmica (RT-LAMP) ha surgido como una poderosa alternativa de RT-PCR debido a su alta sensibilidad y especificidad14,15, y operación de temperatura individual, que significativamente ensayo de baja complejidad y los costos asociados, lo que es adecuado para entornos de bajos recursos. RT-LAMP, como clásicamente se implementa, consta de seis cartillas que se unen a ocho regiones distintas dentro de la meta de RNA. Funciona en temperaturas constantes entre 60 ° C y 70 ° C y utiliza una transcriptasa inversa y una ADN polimerasa con filamento fuerte desplazando la actividad.
Durante las etapas iniciales de RT-LAMP, hacia adelantados y hacia atrás interiores imprimaciones (FIP y BIP, figura 1A) junto con cartillas externas hacia adelantados y hacia atrás (F3 y B3) forman una estructura de la pesa de gimnasia, la estructura de la semilla de la amplificación exponencial de lámpara. Amplificación es aún más acelerada por el lazo hacia adelante y hacia atrás cartillas (LF y LB), que están diseñados para enlazar las regiones solo trenzadas de la pesa de gimnasia, y resultados en la formación de concatemers con la repetición de múltiples lazadas16. LÁMPARA clásica de ensayos basado en turbidez o lectura por ADN intercalando tintes no es totalmente adecuado para detección de punto de atención de Zika, donde es cierto nivel de multiplexación había deseado17,18,19. Multiplexing no es fácilmente obtenido en estos sistemas, ya que son propensos a generar falsos positivos debido a amplificaciones de fuera de objetivo.
Para gestionar estos temas, la literatura agrega un componente adicional en la forma de una “sonda desplace el filamento” a la clásica lámpara RT arquitectura20,21,22. Cada sondeo tiene una región de doble cadena de secuencia-específicas y una región sola cebado. La sonda con la región monocatenario es etiquetada con un fluoróforo de 5′, y la sonda complementaria se modifica con un extintor de extremo 3′. En la ausencia de un objetivo, ninguna fluorescencia se observa debido a la hibridación de los filamentos complementarios de la sonda, que trae el fluoróforo y el quencher en proximidad cercana. En presencia de un objetivo, la sola porción de la sonda fluorescente se une a su complemento en el destino y luego se extiende por un filamento desplazando polimerasa. Extensión adicional de la polimerasa por cartillas inversas provoca la separación del quencher filamento de su filamento fluorescente etiquetado complementario, permitiendo la emisión de fluorescencia ()figura 1B). Con este diseño, la señal es generada después de la formación pesa de gimnasia, reduciendo las posibilidades de las señales de falsos positivos.
La porción de la doble hebra de la sonda desplace el filamento puede ser cualquier secuencia, y cuando se aplica la multiplexación, la misma secuencia puede utilizarse con pares de diferentes fluoróforo-quencher. Con esta arquitectura, contaminados por el virus de la orina, suero o mosquito muestras aplastadas en el papel fueron introducidas directamente en el ensayo sin preparación de la muestra. Lectura de la fluorescencia tricolor visible para el ojo humano se generaron dentro de 30-45 min, y señales fueron visualizadas por un cuadro de observación impreso en 3D que utiliza un LED azul y un filtro naranja. Liofilización de los reactivos de RT-LAMP permitió el despliegue de este kit para bajar la configuración de recursos sin necesidad de refrigeración.
Protocol
Representative Results
Discussion
Virus transmitidos por mosquitos, incluyendo Zika, chikungunya y dengue amenazan la salud pública y la reciente Zika brotes resaltan la necesidad de alternativas de detección del punto de atención de bajo costo para el diagnóstico del paciente, así como para la vigilancia de mosquitos. Se desarrollaron métodos de amplificación isotérmica como alternativas asequibles a los sistemas de polimerización en cadena-basado. Particularmente, las plataformas basadas en RT-lámpara se han aplicado para detectar una amplia …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El trabajo fue apoyado en parte por 1R21AI128188-01 FDOH-7ZK15 y NIAID. Investigación en esta publicación fue apoyada en parte por los institutos nacionales de alergias y enfermedades infecciosas y en parte por biomédica investigación programa de Florida Departamento de salud. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales del Florida Department of Health o NIH. LLC de química combinatoria dinámica es reconocido por su apoyo y contribución a este proyecto.
El virus del dengue 1 (cepa KW010 BOL) fue proporcionado por el Departamento de Florida de salud oficina de laboratorios. Zika virus y el linaje asiático del virus chikungunya fueron proporcionados gentilmente por los centros de Control y prevención de enfermedades. El linaje del océano Índico de virus chikungunya fue amablemente proporcionado por Robert Tesh (centro de referencia mundial de virus emergentes y arbovirus, a través de la rama médica de la Universidad de Texas en Galveston, Texas) a la UF-FMEL. Agradecemos a S. Bellamy, B. Eastmond, S. Ortiz, Velez D., K. Wiggins, ZimLer r. y K. Zirbel para obtener ayuda con los estudios de la infección. También agradecemos a M. S. Kim por proporcionar papel de Q.
Materials
| SafeBlue Illuminator/ Electrophoresis System, MBE-150-PLUS | Major Science | MBE-150 | Gel electrophoresis |
| G:BOX F3 | Syngene | G:BOX F3 | Gel imaging |
| LightCycler 480 Instrument II, 96-well | Roche Applied Science | 05 015 278 001 | Real-time PCR |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | Millipore Sigma | UFC501096 | ultrafiltraton membrane for dialysis |
| Eppendorf 5417C Centrifuge | Marshall Scientific | EP-5417C | centrifuge |
| Myblock Mini Drybath | Benchmark Scientific | BSH200 | drybath |
| FreeZone Plus 6 Liter Cascade Console Freeze Dry System | Labconco | 7934020 | lyophilizer |
| all priers and probes | IDT | custom | RT-LAMP primers and probes |
| dNTP set | Bioline | BIO-39049 | |
| Deoxyuridine Triphosphate (dUTP) | Promega | U1191 | |
| Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase | New England Biolabs | M0538L | enzyme |
| WarmStart RTx Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0380L | enzyme |
| RNase Inhibitor, Murine | New England Biolabs | M0314L | enzyme |
| Antarctic Thermolabile UDG | New England Biolabs | M0372L | enzyme |
| 50bp DNA Step Ladder | Promega | G4521 | marker |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche Applied Science | 4729692001 | real-time RT-LAMP analysis |
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