멀티플렉스 등온 증폭 Zika, Chikungunya, 뎅 그 열의 1 감지 진단 플랫폼을 기반으로

Summary

현재 다중화 Zika, chikungunya, 뎅 그 열 바이러스 복잡 한 샘플 준비 및 비싼 장비를 요구 하 고 저 리소스 환경에서 사용 하기 어려운 검출 하는 진단. 우리는 감지 하 여 높은 감도와 특이성이이 바이러스를 차별화 대상 특정 가닥 displaceable 프로브 등온 증폭을 사용 하는 진단을 보여줍니다.

Abstract

Zika, 뎅기열, chikungunya 바이러스는 전송 모기에 의해 유사한 환자 증상을 가진 질병을 일으키는. 그러나, 다른 다운스트림 환자 환자 전송 잠재력와 매우 다른 환자 치료를 필요로 합니다. 따라서, 최근 Zika 발생 긴급 환자에서 이러한 바이러스를 신속 하 게 차별 하는 도구를 개발 하 게 하 고 모기, 올바른 환자 치료를 선택 하 고 이해 하 고 실시간으로 자신의 역학 관리 갇혀.

불행 하 게도, 그 수신 2016 비상을 포함 하는 현재 진단 테스트 사용 권한 및 긴급 상태, 바이러스 성 RNA 반전 녹음 방송 연쇄 반응 (RT-PCR) 계측을 요구 하 여 훈련, 사용자 감지 및 상당한 샘플 준비입니다. 따라서, 그들은 “승인 된” 기준 실험실, 요구 시간에 전송 되어야 합니다. 실제로, 2016 년 8 월, 센터 질병 통제 (CDC)에 대 한 요청 했다 임산부 누가 왔다 모기에 의해 물리 고 그들이 감염 했다 허용 되지 않는 2 ~ 4 주 학습 전에 기다려야 Zika 나타내는 발진을 개발. 우리는 아주 많이 테스트 사이트, 몇 가지 리소스와 훈련 하지만 반드시 허가 된 직원에 의해 할 수 있는 필요 합니다.

이 비디오는 많은 샘플 준비 없이 소변 또는 (환자)에 대 한 혈 청 또는 짓 눌린된 모기 시체 (대 한 환경 감시), 이러한 규격을 만족 하는 분석 결과 보여 줍니다. 모기 시체 4 급 암모늄 그룹 (Q-종이) 암모니아 처리 뒤에 생물 학적 관리를 들고 종이에 캡처됩니다. 이 다음 직접, RNA 격리 없이 넣고 냉동의 아무 사슬 필요 동결된 시 약을 포함 하는 분석 결과 튜브. 수정 된 형태의 특정 대상 붙일 태그가 displaceable 프로브 루프 중재 등온 증폭 반전 녹음 방송 3 색 형광 신호 판독, 30 분에 생성합니다. 이 오렌지 필터 휴대용, 배터리 구동 장치 시각 이다. 밀봉 된 튜브와 dUTP 증폭 혼합물에 존재 thermolabile uracil DNA glycosylase (UDG)를 사용 하 여 앞으로 오염 방지 된다.

Introduction

모기 품 어진 바이러스 감염, 뎅기열, Zika 바이러스, chikungunya, 등 상승 및 수요 즉시 관리 전략에 있다. 뎅 그 열과 chikungunya 바이러스는 이미 많은 Zika 서반구¹확산 지금 열 대 지역에서 발병. Zika 바이러스, 뎅기열, 같은 Flaviviridae 가족의 멤버 이며 한 아시아와 아프리카 유전 계보²개의 아프리카 출신 이다. Zika 바이러스의 식별 거슬러 1947, 비록 인간에서 Zika 감염 태평양 및 아메리카에서 신흥 전에 반세기에 대 한 산발적 남아. 2007 년에 미크로네시아 야프 섬에 발생 하는 발열 Zika의 첫 번째 보고 발발 뒤 2013과 2014 년에 프랑스령 폴리네시아. 아메리카에 있는 첫 번째 주요 발발 2015 년에서 브라질에서 발생 했습니다.

Zika, chikungunya, 뎅 기 바이러스는 주로 Aedes aegypti Aedes albopictus에의해 전송 됩니다. 그러나, Zika 추가 다운스트림 인간에 인간 전송 가능성, 아마 성적 접촉, 어머니 태아 상호 작용, 및^3,,45모유를 통해 확산 되 고 있다. Zika 발열만 가벼운 질병을 처음으로 알려졌다. 그러나, 그것은 나중 어른에 Guillain-바레 증후군, 신생아, 그리고 지난 달에 년 수 있습니다 만성 musculoskeletal 질환 microcephaly 연관. Zika 질병의 진단 Zika 감염의 증상은 다른 모기 확산 바이러스⁶의 것과 유사 하기 때문에, 도전적 일 수 있습니다. 이러한 바이러스의 일반적인 공동 감염 확인 차별 진단 더욱 도전^7,8. 따라서, Zika와 다른 바이러스 핵 산의 신속 하 고 신뢰할 수 있는 검색 실시간으로, 제어 및 예방 측정을 시작 하 고 환자 치료⁹를 관리 하는 역학을 이해 하는 것 필요 합니다.

이 바이러스에 대 한 현재 진단 테스트는 혈 청 학적인 검사, 바이러스, 바이러스 시퀀싱, 고립과 반전 전사 PCR (RT-PCR) 포함 됩니다. 표준 혈 청 학적인 접근은 종종 부적 절 한 감도에서 고통 그리고 결과 다른 flaviviruses에 의해 이전에 감염 환자에서 분에 의해 복잡 하 게 될 수 있습니다.

따라서, 핵 산 테스트 감지 하 고이 바이러스를 차별화 하는 가장 신뢰할 수 있는 방법에 남아 있다. Zika 다른 모기 품 어진 바이러스의 검출은 일반적으로 RT-PCR 또는 생물 학적 체액, 혈 청, 소변, 타 액, 정액, 모유, 그리고 대뇌 유체^10,11등의 다양 한 실시간 RT-PCR를 사용 하 여 수행 됩니다. 소변과 타 액 샘플은 그들은 전시 적은 PCR 저해, 높은 바이러스 부하, 오랜 시간, 그리고 수집 및 처리^12,13의 증가 용이성에 대 한 바이러스 존재 하기 때문에 혈액, 동안 일반적으로 선호. 그러나, RT-PCR 기반 진단 테스트를 구성 하는 광범위 한 샘플 준비 단계와 덜 포인트의 케어에 대 한 최적의 만드는 비싼 열 사이클링 장비.

반전 녹음 방송 루프 중재 등온 증폭 (RT-램프) 높은 감도 및 특이성¹⁴강력한 RT-PCR 대 안으로 떠오르고 있다, 생물에 금지 물질에 대 한 관용 샘플링¹⁵, 그리고 단일 온도 크게 낮춘 다 시험의 복잡성 및 관련 된 비용, 낮은 자원 환경에 적합 하에 작업. RT-램프, 고전적인 구현 6 뇌관 대상 RNA 내에서 8 가지 영역에 바인딩되는 구성 되어 있습니다. 60 ° C 및 70 ° C, 사이 일정 한 온도에서 실행 하 고 활동을 전치 하는 강한 가닥으로는 역전사 효소 및 DNA 중 합 효소를 사용 하 여.

RT-램프의 초기 단계 동안 앞뒤로 내부 뇌관 (FIP, BIP, 그림 1A) 외부 앞뒤로 뇌관 (f 3와 B3) 함께 아령 구조 지 수 램프 증폭의 씨앗 구조를 형성합니다. 증폭 루프 앞뒤로 뇌관 (LF와 파운드), 아령의 단일 좌초 지역 바인딩할 설계에 의해 더욱 가속 그리고 여러 반복 concatemers의 형성에서 결과¹⁶루프. 클래식 램프에 따라 탁도 분석 실험 또는 Zika, 다중화의 어느 정도 포인트의 케어 탐지 원하는^17,18,19대 한 DNA intercalating 염료에 의해 판독은 완전히 적합 하지 않습니다. 멀티플렉싱은 하지 쉽게 얻을 이러한 시스템은 오프 대상 확대로 인해 가양성을 생성 하는 경향이.

이러한 문제를 관리 하기 위해 문학 클래식 RT 램프 아키텍처^20,,2122“물가 전치 프로브”의 형태로 추가 구성 요소를 추가 합니다. 각 프로브는 시퀀스 관련 이중 가닥 지역 및 단일 가닥 못쓰게 지역. 단일 가닥 지역 조사는 5′-fluorophore, 태그입니다 그리고 보완 조사 3′-끝 끄는 수정 됩니다. 대상의 부재에서 아무 형광 근접에 fluorophore 및 끄는 보완 조사 가닥의 교 잡 때문에 관찰 된다. 대상 존재 형광 프로브의 단일 가닥 부분 대상에서의 보완을 하 고 중 합 효소를 전치 하는 물가 의해 확장 됩니다. 반전 뇌관에 의해 더 중 합 효소 확장 하면 형광 (그림 1B)의 방출을 허용의 보완 붙일 레이블된 스트랜드에서 끄는 가닥의 분리. 이 디자인으로, 신호는 긍정 신호의 가능성을 감소 아령 형성 후 생성 됩니다.

더블-좌초 부분의 물가 전치 프로브 어떤 시퀀스 수 있으며 멀티플렉싱 적용 될 때 동일한 시퀀스가 다른 fluorophore-끄는 쌍 함께 사용할 수 있습니다. 이 아키텍처, 바이러스에 오염 된 소변, 혈 청, 또는 모기 샘플 종이에 지기까지 직접 샘플 준비 없이 분석 결과를 소개 했다. 3 색 형광 지요 인간의 눈에 보이지는 30-45 분 내에서 생성 된 고 신호 3D 인쇄 관찰 상자 블루 LED와 오렌지 필터를 사용 하 여 시각화 했다. RT-램프 시 약 freeze-drying 냉장에 대 한 필요 없이 리소스 설정을 낮은이 키트의 배포를 사용할 수 있습니다.

Protocol

참고: 모기는이 연구에 직접 사용 하는 유일한 동물 이었다. 누구의 혈액 감염 된 모기를 피드 하는 데 사용 되었다, 닭을 관리 하는 절차 플로리다 대학 기관 동물 관리 및 사용 Committee.Virus 전파 IACUC 프로토콜 # 201507682로 승인 했다 및 모기 감염 연구 했다 층 RT-램프 실험 FfAME와 건배, 플로리다에서 파이어 버드 바이오 과학 LLC BSL-2 실험실에서 수행한 Vero 비치에서 플로리다 의학 곤충학 실험실의 B…

Representative Results

처음에, 각 RT 램프 뇌관 (표 1)는 해당 바이러스 성 RNA 기판 뿐만 아니라 부정적인 컨트롤의 젤 전기 이동 법으로 평가 됐다. RT-램프 뇌관 Chikungunya에 대 한 대상 NS5 (RNA 의존 RNA 중 합 효소) Zika 및 뎅기열 1, 지역과 nsP2 지역 (비 구조 단백질 P2) 하도록 설계 되었습니다. 서식 파일 총 RNA 바이러스 주식 교양된 아프리카 녹색 원숭이 신장 (Vero) 세포에서에서 추출 했…

Discussion

Zika, chikungunya, 뎅기열 등 모기 매개 바이러스 위협 공중 보건 및 최근 Zika 확산 강조 저가 포인트의 케어 탐지 대안 모기 감시 뿐만 아니라 환자 진단에 대 한 필요 합니다. 등온 증폭 방법 저렴 한 대안 PCR 기반 시스템으로 개발 되었다. 특히, RT-램프-기반 플랫폼 다양 한 병원 체 검출 적용 되었습니다. 그러나, 등온선 플랫폼의 사용 주로 단일 대상 검색 제한 되었습니다. 보고 하는 방법 여기를 사?…

Materials

SafeBlue Illuminator/ Electrophoresis System, MBE-150-PLUS	Major Science	MBE-150	Gel electrophoresis
G:BOX F3	Syngene	G:BOX F3	Gel imaging
LightCycler 480 Instrument II, 96-well	Roche Applied Science	05 015 278 001	Real-time PCR
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane	Millipore Sigma	UFC501096	ultrafiltraton membrane for dialysis
Eppendorf 5417C Centrifuge	Marshall Scientific	EP-5417C	centrifuge
Myblock Mini Drybath	Benchmark Scientific	BSH200	drybath
FreeZone Plus 6 Liter Cascade Console Freeze Dry System	Labconco	7934020	lyophilizer
all priers and probes	IDT	custom	RT-LAMP primers and probes
dNTP set	Bioline	BIO-39049
Deoxyuridine Triphosphate (dUTP)	Promega	U1191
Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase	New England Biolabs	M0538L	enzyme
WarmStart RTx Reverse Transcriptase	New England Biolabs	M0380L	enzyme
RNase Inhibitor, Murine	New England Biolabs	M0314L	enzyme
Antarctic Thermolabile UDG	New England Biolabs	M0372L	enzyme
50bp DNA Step Ladder	Promega	G4521	marker
LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white	Roche Applied Science	4729692001	real-time RT-LAMP analysis