मल्टीप्लेक्स इज़ोटेर्माल प्रवर्धन आधारित नैदानिक मंच Zika, Chikungunya, और डेंगू का पता लगाने के लिए 1
Summary
वर्तमान मल्टीप्लेक्स निदान Zika, chikungunya, और डेंगू वायरस का पता लगाने के लिए जटिल नमूना तैयारी और महंगी इंस्ट्रूमेंटेशन की आवश्यकता होती है, और कम संसाधन वातावरण में उपयोग करने के लिए कठिन है । हम एक नैदानिक कि लक्ष्य विशेष किनारा विस्थापन जांच के साथ इज़ोटेर्माल प्रवर्धन का पता लगाने और उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता के साथ इन वायरस अंतर का उपयोग करता है दिखाते हैं ।
Abstract
Zika, डेंगू, और chikungunya वायरस मच्छरों द्वारा फैलता है, इसी तरह के रोगी लक्षण के साथ रोगों के कारण । हालांकि, वे अलग बहाव रोगी के लिए रोगी संचरण क्षमता है, और बहुत अलग रोगी उपचार की आवश्यकता होती है । इस प्रकार, हाल ही में Zika प्रकोप यह उपकरण है कि तेजी से रोगियों और फंसे मच्छरों में इन वायरस भेदभाव, सही रोगी उपचार का चयन करने के लिए, और समझने और वास्तविक समय में उनके जानपदिक रोग विज्ञान का प्रबंधन करने के लिए विकसित करने के लिए अत्यावश्यक बनाते हैं ।
दुर्भाग्य से, 2016 आपातकालीन उपयोग प्राधिकरण और फास्ट ट्रैक स्थिति प्राप्त करने सहित वर्तमान नैदानिक परीक्षणों, रिवर्स प्रतिलेखन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी-पीसीआर), जो इंस्ट्रूमेंटेशन, प्रशिक्षित उपयोगकर्ताओं की आवश्यकता है द्वारा वायरल आरएनए का पता लगाने, और काफी नमूना तैयारी । इस प्रकार, वे “अनुमोदित” संदर्भ प्रयोगशालाओं के लिए भेजा जाना चाहिए, समय की आवश्यकता होती है । दरअसल, अगस्त 2016 में, रोग नियंत्रण के लिए केंद्र (सीडीसी) गर्भवती महिलाओं को जो एक मच्छर ने काटा गया था पूछ रहा था और एक Zika का संकेत दाने विकसित करने के लिए सीखने से पहले एक अस्वीकार्य 2 से 4 सप्ताह इंतजार है कि वे संक्रमित थे । हम बहुत अधिक परीक्षण है कि साइट पर किया जा सकता है की जरूरत है, कुछ संसाधनों के साथ, और प्रशिक्षित लेकिन जरूरी नहीं कि लाइसेंस प्राप्त कर्मियों द्वारा ।
यह वीडियो एक परख है कि इन विनिर्देशों को पूरा करता है, मूत्र या सीरम (रोगियों के लिए) या कुचल मच्छर लावे (पर्यावरण निगरानी के लिए) के साथ काम, सब बहुत नमूना तैयारी के बिना दर्शाता है । मच्छर लावे कागज पर कब्जा कर लिया चतुर्धातुक अमोनियम समूहों (क्यू कागज) अमोनिया उपचार द्वारा पीछा करने के लिए कर रहे है के लिए खतरा । ये तो सीधे, आरएनए अलगाव के बिना कर रहे हैं, परख स्थिर युक्त एजेंट है कि प्रशीतन की कोई श्रृंखला की जरूरत है ट्यूब में डाल दिया । रिवर्स प्रतिलेखन पाश के एक संशोधित रूप-लक्ष्य के साथ मध्यस्थता इज़ोटेर्माल प्रवर्धन-विशिष्ट फ्लोरोसेंट टैग विस्थापित जांच readout पैदा करता है, 30 मिनट में, एक तीन रंग प्रतिदीप्ति संकेत के रूप में. यह एक handheld, बैटरी चालित एक नारंगी फिल्टर के साथ डिवाइस के साथ कल्पना की है । आगे संदूषण सील ट्यूबों के साथ रोका है, और प्रवर्धन मिश्रण में dUTP की उपस्थिति में thermolabile uracil डीएनए glycosylase (UDG) का उपयोग करें ।
Introduction
डेंगू, chikungunya, और Zika वायरस सहित मच्छर जनित विषाणु संक्रमण बढ़ रहे हैं और तत्काल प्रबंधन रणनीतियों की मांग कर रहे हैं । डेंगू और chikungunya वायरस पहले से ही उष्णकटिबंधीय क्षेत्रों में से कई में स्थानिकमारी वाले हैं, जहां Zika अब पश्चिमी गोलार्द्ध1में फैल रहा है । Zika वायरस, डेंगू की तरह, Flaviviridae परिवार का एक सदस्य है और एक एशियाई और दो अफ्रीकी आनुवंशिक वंश2के साथ अफ्रीका के मूल निवासी है । हालांकि Zika वायरस की पहचान 1947 को वापस तिथियों, मनुष्यों में Zika संक्रमण प्रशांत और अमेरिका में उभरने से पहले एक आधा सदी के लिए छिटपुट बने रहे । Zika ज्वर की पहली रिपोर्ट प्रकोप माइक्रोनेशिया के संयुक्त राज्य अमेरिका में 2007 में याप के द्वीप पर हुई, फ्रेंच पोलिनेशिया द्वारा 2013 और 2014 में पीछा किया । अमेरिका में पहला बड़ा प्रकोप ब्राजील में 2015 में हुआ ।
Zika, chikungunya, और डेंगू वायरस मुख्यतः एडीज aegypti और एडीज albopictusसे फैलता है । हालांकि, Zika अतिरिक्त बहाव मानव के लिए मानव संचरण संभावनाओं, यौन संपर्क, मां से भ्रूण बातचीत के माध्यम से फैलता जा रहा है, और स्तनपान के माध्यम से3,4,5। Zika बुखार को पहले केवल हल्के बीमारी का कारण माना गया था. हालांकि, यह बाद में वयस्कों में Guillain-Barré सिंड्रोम, नवजात शिशुओं में microcephaly के साथ जुड़ा हुआ था, और पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस रोगों है कि साल के लिए पिछले महीने मई । Zika बीमारी के निदान चुनौतीपूर्ण हो सकता है, के बाद से एक Zika संक्रमण के लक्षण अन्य मच्छर फैले वायरस के उन लोगों के समान हैं6. आम सह इन विषाणुओं के संक्रमण में अंतर निदान भी अधिक7,8चुनौतीपूर्ण बनाते हैं । इसलिए, Zika और अंय वायरस से न्यूक्लिक एसिड का तेजी से और विश्वसनीय पता लगाने के लिए वास्तविक समय में जानपदिक रोग विज्ञान को समझने की जरूरत है, नियंत्रण और निवारक उपायों शुरू करने के लिए, और रोगी देखभाल9का प्रबंधन ।
इन वायरसों के लिए वर्तमान नैदानिक परीक्षणों में सीरम वैज्ञानिक परीक्षण, वायरस अलगाव, वायरस अनुक्रमण, और रिवर्स-प्रतिलेखन पीसीआर (RT-पीसीआर) शामिल हैं । मानक सीरम वैज्ञानिक दृष्टिकोण अक्सर अपर्याप्त संवेदनशीलता से ग्रस्त है और परिणाम जो पहले से अंय flaviviruses द्वारा संक्रमित किया गया है रोगियों में क्रॉस-जेट द्वारा जटिल हो सकता है ।
इसलिए, न्यूक्लिक एसिड परीक्षण इन वायरस का पता लगाने और अंतर करने के लिए सबसे विश्वसनीय तरीका रहता है । Zika और अन्य मच्छर जनित विषाणुओं का पता लगाने आमतौर पर आरटी-पीसीआर या वास्तविक समय आरटी-पीसीआर का उपयोग जैविक तरल पदार्थ, जैसे सीरम, मूत्र, लार, वीर्य, स्तन के दूध, और मस्तिष्क द्रव10,11के रूप में किया जाता है । मूत्र और लार के नमूने आम तौर पर खून से अधिक पसंद कर रहे हैं, क्योंकि वे कम पीसीआर प्रदर्शन, अवरोध, उच्च वायरल लोड, समय की लंबी अवधि के लिए वायरस उपस्थिति, और संग्रह में वृद्धि की आसानी और हैंडलिंग12,13. आर टी-पीसीआर आधारित नैदानिक परीक्षण, तथापि, व्यापक नमूना तैयारी कदम और महंगा थर्मल सायक्लिंग उपकरण शामिल हैं, यह बात की देखभाल के लिए कम इष्टतम बना ।
रिवर्स प्रतिलेखन पाश-मध्यस्थता इज़ोटेर्माल प्रवर्धन (आरटी-लैंप) अपनी उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता14, जैविक नमूनों में निरोधात्मक पदार्थों के लिए अपनी सहनशीलता15के कारण एक शक्तिशाली आरटी-पीसीआर विकल्प के रूप में उभरा है, और एकल तापमान पर आपरेशन, जो काफी परख जटिलता और संबद्ध लागत कम करती है, यह कम संसाधन वातावरण के लिए उपयुक्त बना । RT-दीपक, के रूप में यह प्रतिष्ठित लागू किया जाता है, छह प्राइमरों कि लक्ष्य आरएनए के भीतर आठ अलग क्षेत्रों के लिए बाध्य शामिल हैं. यह 60 डिग्री सेल्सियस और 70 डिग्री सेल्सियस के बीच लगातार तापमान पर चलाता है, और एक रिवर्स transcriptase और मजबूत किनारा गतिविधि को बदलने के साथ एक डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग करता है ।
RT-लैंप, फॉरवर्ड और पिछड़े आंतरिक प्राइमरों (FIP और बिप, आंकड़ा 1a) के प्रारंभिक चरणों के दौरान बाहरी आगे और पीछे प्राइमरों के साथ (F3 और B3) एक dumbbell संरचना फार्म, घातीय लैंप प्रवर्धन की बीज संरचना । प्रवर्धन आगे पाश और पिछड़े प्राइमरों (वामो और पौंड), जो dumbbell के एकल असहाय क्षेत्रों बांध करने के लिए तैयार कर रहे हैं द्वारा त्वरित है, और एकाधिक दोहरा छोरों के साथ concatemers के गठन में परिणाम16. turbidity या डीएनए intercalating रंजक द्वारा readout के आधार पर शास्त्रीय लैंप परख पूरी तरह से Zika, जहां मल्टीप्लेक्स के कुछ स्तर वांछित है के बिंदु की देखभाल का पता लगाने के लिए अनुकूल नहीं है17,18,19। मल्टीप्लेक्स आसानी से इन प्रणालियों में प्राप्त नहीं है, क्योंकि वे झूठी-सकारात्मक बंद लक्ष्य प्रवर्धन के कारण उत्पंन करने के लिए प्रवण हैं ।
इन मुद्दों का प्रबंधन करने के लिए, साहित्य शास्त्रीय आरटी-दीपक वास्तुकला20,21,22के लिए एक “किनारा-जगह जांच” के रूप में एक अतिरिक्त घटक जोड़ता है । प्रत्येक जांच एक अनुक्रम विशिष्ट दोहरे-किनारा क्षेत्र और एक एकल असहाय भड़काना क्षेत्र है । एकल-कतरा क्षेत्र के साथ जांच एक 5 ‘ के साथ टैग-fluorophore है, और पूरक जांच एक 3 ‘ अंत शमनकर्ता के साथ संशोधित किया गया है । एक लक्ष्य के अभाव में, कोई प्रतिदीप्ति पूरक जांच किस्में, जो fluorophore और शमनकर्ता करीब निकटता में लाता है की संकरण के कारण मनाया जाता है । एक लक्ष्य की उपस्थिति में, फ्लोरोसेंट जांच के एकल-असहाय भाग के लक्ष्य पर अपने पूरक को बांधता है, और फिर एक कतरा पोलीमरेज़ जगह से बढ़ा है । इसके अलावा रिवर्स प्राइमरों द्वारा पोलीमरेज़ विस्तार इसके पूरक फ्लोरोसेंट लेबल कतरा से शमन किनारा की जुदाई का कारण बनता है, प्रतिदीप्ति के उत्सर्जन की अनुमति (आंकड़ा 1b)। इस डिजाइन के साथ, संकेत dumbbell गठन के बाद उत्पन्न होता है, झूठी सकारात्मक संकेतों की संभावना को कम करने.
किनारा-विक्रमण जांच के दोहरे कतरा भाग किसी भी अनुक्रम हो सकता है, और जब मल्टीप्लेक्स लागू किया जाता है, एक ही अनुक्रम अलग fluorophore-शमन के जोड़े के साथ प्रयोग किया जा सकता है । इस वास्तुकला के साथ, वायरस दूषित मूत्र, सीरम, या मच्छर के नमूने कागज पर squished सीधे नमूने की तैयारी के बिना परख करने के लिए पेश किया गया । तीन रंग प्रतिदीप्ति पढ़ने के बहिष्कार मानव आंख को दिखाई 30-45 मिनट के भीतर उत्पंन किया गया, और संकेत एक 3 डी-मुद्रित अवलोकन बॉक्स है कि एक नीली एलईडी और एक नारंगी फिल्टर का उपयोग करता है द्वारा visualized थे । फ्रीज-आर टी-लैंप रिएजेंट्स इस किट के परिनियोजन के लिए प्रशीतन के लिए एक की आवश्यकता के बिना कम संसाधन सेटिंग्स सक्षम है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
Zika, chikungunya, और डेंगू सहित मच्छर जनित वायरस सार्वजनिक स्वास्थ्य और हाल ही में Zika फैलने की धमकी रोगी निदान के लिए कम लागत बिंदु की देखभाल का पता लगाने के विकल्प, साथ ही मच्छर निगरानी के लिए की जरूरत पर प्रकाश डा…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
कार्य FDOH-7ZK15 और NIAID 1R21AI128188-01 द्वारा भाग में समर्थित किया गया था । अनुसंधान इस प्रकाशन में रिपोर्ट एलर्जी और संक्रामक रोगों के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा भाग में समर्थित किया गया था, और भाग में जैव चिकित्सा अनुसंधान स्वास्थ्य विभाग के फ्लोरिडा के द्वारा कार्यक्रम । सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिंमेदारी है और जरूरी नहीं कि NIH या फ्लोरिडा स्वास्थ्य विभाग के सरकारी विचारों का प्रतिनिधित्व करते हैं । गतिशील मिश्रित रसायन LLC उनके समर्थन और इस परियोजना के लिए योगदान के लिए स्वीकार किया है ।
डेंगू 1 वायरस (तनाव BOL-KW010) कृपया फ्लोरिडा स्वास्थ्य ब्यूरो की प्रयोगशालाओं के विभाग द्वारा प्रदान की गई थी । Zika वायरस और chikungunya वायरस के एशियाई वंश विनय रोग नियंत्रण और रोकथाम के लिए केंद्र द्वारा प्रदान की गई । हिंद महासागर chikungunya वायरस के वंश कृपया रॉबर्ट तेश्वर द्वारा प्रदान की गई थी (विश्व संदर्भ उभरते वायरस और Arboviruses के लिए केंद्र, Galveston में टेक्सास चिकित्सा शाखा के विश्वविद्यालय के माध्यम से, टेक्सास) के लिए-FMEL । हम संक्रमण अध्ययन के साथ सहायता के लिए एस. Bellamy, बी. Eastmond, एस. Ortiz, डी. वेलेज़, के. Wiggins, आर. ZimLer, और के. Zirbel का धन्यवाद करते हैं । क्यू-पेपर प्रदान करने के लिए हम एम. एस. किम का भी धन्यवाद करते हैं ।
Materials
| SafeBlue Illuminator/ Electrophoresis System, MBE-150-PLUS | Major Science | MBE-150 | Gel electrophoresis |
| G:BOX F3 | Syngene | G:BOX F3 | Gel imaging |
| LightCycler 480 Instrument II, 96-well | Roche Applied Science | 05 015 278 001 | Real-time PCR |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | Millipore Sigma | UFC501096 | ultrafiltraton membrane for dialysis |
| Eppendorf 5417C Centrifuge | Marshall Scientific | EP-5417C | centrifuge |
| Myblock Mini Drybath | Benchmark Scientific | BSH200 | drybath |
| FreeZone Plus 6 Liter Cascade Console Freeze Dry System | Labconco | 7934020 | lyophilizer |
| all priers and probes | IDT | custom | RT-LAMP primers and probes |
| dNTP set | Bioline | BIO-39049 | |
| Deoxyuridine Triphosphate (dUTP) | Promega | U1191 | |
| Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase | New England Biolabs | M0538L | enzyme |
| WarmStart RTx Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0380L | enzyme |
| RNase Inhibitor, Murine | New England Biolabs | M0314L | enzyme |
| Antarctic Thermolabile UDG | New England Biolabs | M0372L | enzyme |
| 50bp DNA Step Ladder | Promega | G4521 | marker |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche Applied Science | 4729692001 | real-time RT-LAMP analysis |
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