Aktuella multiplexed diagnostik att upptäcka Zika, chikungunya, denguefeber virus kräver komplexa provberedning och dyra instrumentering och är svåra att använda i låg resurs miljöer. Vi visar en diagnostik som använder isotermiska förstärkning med målet-specifika strand displaceable sonder att identifiera och särskilja dessa virus med hög känslighet och specificitet.
Zika, denguefeber och chikungunya virus överförs av myggor, orsakar sjukdomar med liknande patientens symtom. Men de har olika nedströms patient-till-patient överföring potential, och kräver mycket olika patienten behandlingar. Alltså senaste Zika utbrott gör det angeläget att utveckla verktyg som snabbt diskriminerar dessa virus hos patienter och instängd myggor, välja rätt patient behandling, och för att förstå och hantera deras epidemiologi i realtid.
Tyvärr, nuvarande diagnostiska tester, inklusive de mottagande 2016 nödsituation använder auktoriseringar och påskyndat status, upptäcka viralt RNA av omvänd Transkription polymeras-kedjereaktion (RT-PCR), som kräver instrumentering, utbildade användare, och betydande provberedning. Således måste de skickas till ”godkänd” referenslaboratorier, som kräver tid. Faktiskt i augusti 2016, Center for Disease Control (CDC) frågade gravida kvinnor som hade varit biten av en mygga och utvecklat ett Zika-indikerande utslag vänta en oacceptabel 2 till 4 veckor före lärande oavsett om de var infekterade. Vi behöver mycket tester som kan göras på plats, med några resurser och av utbildade men inte nödvändigtvis legitimerad personal.
Denna video visar en analysmetod som uppfyller dessa specifikationer, arbetar med urin eller serum (för patienter) eller krossade mygga slaktkroppar (för miljömässiga övervakning), alla utan mycket provberedning. Mygga slaktkroppar Fångas på papper som transporterar kvaternära ammoniumsalter grupper (Q-papper) följt av ammoniak behandling för att hantera biologiska. Dessa sedan sätts direkt, utan RNA isolering, in i analysen rör som innehåller frystorkade reagenser som behöver ingen kedja av kylanläggningar. En modifierad form av omvänd Transkription loop-medierad isotermiska förstärkning med målet-specifika fluorescently märkta displaceable prober producerar avläsning, i 30 min, som en tre-Color fluorescens-signal. Detta visualiseras med en handhållen, batteridriven enhet med en orange filter. Framåt kontaminering förhindras med förslutna rör, och användningen av termolabila uracil DNA glykosylas (UDG) i närvaro av dUTP i förstärkning blandningen.
Moskitburen virusinfektioner, bland annat denguefeber och chikungunya Zika virus är på uppgång och efterfrågan omedelbar hantering strategier. Denguefeber och chikungunya virus är redan endemisk i många tropiska regioner där Zika sprider sig nu i den västra halvklot1. Zikavirus, som denguefeber, är medlem av flavivirus -familjen och är infödd till Afrika med en asiatisk och två afrikanska genetiska härstamningar2. Även om identifiering av zikaviruset går tillbaka till 1947, förblev Zika infektion hos människa sporadisk för ett halvt sekel innan framväxande i Stillahavsområdet och Amerika. Det första rapporterade utbrottet av Zika feber inträffade på ön av Yap i Mikronesiens federerade stater i 2007, följt av franska Polynesien i 2013 och 2014. Det första större utbrottet i Amerika uppstod under 2015 i Brasilien.
Zika, denguefeber och chikungunya virus överförs främst av Aedes aegypti och Aedes albopictus. Zika har dock ytterligare nedströms människa till människa överföringsmöjligheter, sannolikt sprids genom sexuell kontakt, mor-till-fostret interaktion, och via amning3,4,5. Zika feber var först tros orsaka endast mild sjukdom. Det var dock senare knutna Guillain-Barrés syndrom hos vuxna, mikrocefali hos nyfödda, och kroniska muskuloskeletala sjukdomar som får sista månader till år. Diagnos av Zika sjukdom kan vara svårt, eftersom symptomen på en Zika infektion är liknande dem i andra mygga-spread virus6. Gemensamma samtidiga infektioner av dessa virus gör differentialdiagnos ännu mer utmanande7,8. Därför behövs snabb och pålitlig detektering av nukleinsyror från Zika och andra virus att förstå epidemiologi i realtid, att initiera kontroll och förebyggande åtgärder, och att hantera patientvården9.
Aktuella diagnostiska tester för dessa virus inkluderar serologiska tester, virusisolering, virus sekvensering och PCR-omvänd-Transkription (RT-PCR). Serologiska standardmetoder lider ofta otillräcklig känslighet och resultaten kan kompliceras av korsreaktivitet hos patienter som tidigare har blivit smittad av andra flavivirus.
Nukleinsyra testning förblir därför det mest tillförlitliga sättet att identifiera och särskilja dessa virus. Upptäckt av Zika och andra moskitburen virus utförs oftast med RT-PCR eller realtid RT-PCR i mängd biologiska vätskor, såsom serum, urin, saliv, sperma, bröstmjölk och cerebral vätska10,11. Urin och saliv prover är generellt att föredra över blod, sedan de ställer ut mindre PCR-hämning, högre virusbelastning, virus närvaro för längre tidsperioder och ökad användarvänlighet insamling och hantering av12,13. RT-PCR-baserade diagnostiska tester, består dock omfattande provberedningssteg och dyra termisk cykling utrustning, vilket gör det mindre optimalt för den point-of-care.
Omvänd Transkription loop-medierad isotermiska amplifiering (RT-lampa) har vuxit fram som ett kraftfullt RT-PCR-alternativ på grund av dess höga känslighet och specificitet14, dess tolerans för hämmande ämnen i biologiska prover15, och operation på inre temperatur, vilket avsevärt sänker assay komplexitet och tillhörande kostnader, vilket gör den lämplig för låg resurs miljöer. RT-lampa, som det klassiskt genomföras, består av sex primers som binder till åtta olika regioner inom ramen för målet RNA. Det går på konstant temperatur mellan 60 ° C och 70 ° C, och använder ett omvänt transkriptas och ett DNA-polymeras med stark strand undantränger aktivitet.
Under de inledande skedena av RT-lampa bildar framåt och bakåt inre primers (FIP och BIP, figur 1A) tillsammans med yttre framåt och bakåt primers (F3 och B3) en hantel struktur, utsäde strukturen av exponentiell lampa förstärkning. Förstärkning ytterligare påskyndas av loop framåt och bakåt primers (LF och LB), som utformats för att binda de enda stranded regionerna av hantel och resulterar i bildandet av concatemers med flera upprepade loopar16. Klassisk lampa analyser utifrån grumlighet eller avläsning av DNA infoga färgämnen är inte helt lämpad för point-of-care detektion av Zika, där en viss nivå av multiplexing är önskas17,18,19. Multiplexing är inte lätt erhållas i dessa system eftersom de är benägna att generera falsk-positiv på grund av off-target kompletteringar.
För att hantera dessa frågor, lägger litteraturen en extra komponent i form av en ”strand-undantränger sond” den klassiska RT-lampa arkitektur20,21,22. Varje sond har en sekvens-specifik dubbel-strand och ett enkelsträngat priming-region. Sonden med enkelsträngat regionen är Taggad med en 5′-fluorophore och kompletterande sonden är modifierad med en 3′-änden törstsläckare. I avsaknad av ett mål observeras ingen fluorescens på grund av hybridisering av kompletterande sonden strandar, som ger den fluorophore och törstsläckare i närheten. I närvaro av ett mål, enkelsträngat portion av fluorescerande sonden binder till dess komplement på målet, och förlängs sedan med en strand undantränger polymeras. Ytterligare polymeras förlängning av omvänd primrar orsakar separation av törstsläckare strand från dess kompletterande fluorescently märkt strand, att tillåta utsläpp av fluorescens ()figur 1B). Med denna design genereras signalen efter hantel bildandet, minska risken för falskt positiva signaler.
Dubbelsträngat portion av strand-undantränger sonden kan vara valfri sekvens, och när multiplexing tillämpas samma sekvens kan användas med olika fluorophore-törstsläckare par. Med denna arkitektur, virus-förorenat urin, serum eller mygga infördes direkt prover squished på papper till analysen utan provberedning. Tre-Color fluorescens Läs-outs mänskliga ögat genererades inom 30-45 min och signaler var visualiserat av en 3D-tryckt observation ruta som använder en blå LED och en apelsin filter. Frystorkning RT-lampa reagenserna aktiverad distribution av detta kit till lägre resursinställningar utan behov av kylning.
Mygga blodburna virus Zika, denguefeber och chikungunya hotar folkhälsan och senaste Zika utbrott höjdpunkt behovet av låg kostnad point-of-care upptäckt alternativ för patientens diagnostik, samt för mygga övervakning. Isotermiska förstärkning metoder utvecklades som prisvärt alternativ till PCR-baserat system. Särskilt, har RT-lampa-baserade plattformar tillämpats för att upptäcka ett brett utbud av patogener. Användning av isotermiska plattformar har dock främst begränsat till enda måldetektering. Me…
The authors have nothing to disclose.
Arbetet stöds delvis av FDOH-7ZK15 och NIAID 1R21AI128188-01. Forskning som redovisas i denna publikation var stöds delvis av nationella institut för allergi och infektionssjukdomar, och delvis av biomedicinsk forskning Program av Florida Department of Health. Innehållet ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis de officiella utsikt över NIH eller Florida Department of Health. Dynamiska kombinatorisk kemi LLC är erkänt för deras stöd och bidrag till detta projekt.
Denguefeber 1 virus (stam BOL-KW010) var vänligt tillhandahålls av Florida Institutionen för hälsa presidiet av laboratorier. Zikaviruset och den asiatiska stammen av Chikungunyaviruset tillhandahölls nådigt av Centers for Disease Control och Prevention. Den indiska Ocean stammen av Chikungunyaviruset var vänligen tillhandahållen av Robert Tesh (World Reference Center för framväxande virus och Arboviruses, genom den University of Texas Medical Branch i Galveston, Texas) till den UF-FMEL. Vi tackar S. Bellamy, B. Eastmond, S. Ortiz, D. Velez, K. Wiggins, R. ZimLer och K. Zirbel för hjälp med infektion studierna. Vi tackar också M. S. Kim för att tillhandahålla Q-papper.
SafeBlue Illuminator/ Electrophoresis System, MBE-150-PLUS | Major Science | MBE-150 | Gel electrophoresis |
G:BOX F3 | Syngene | G:BOX F3 | Gel imaging |
LightCycler 480 Instrument II, 96-well | Roche Applied Science | 05 015 278 001 | Real-time PCR |
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | Millipore Sigma | UFC501096 | ultrafiltraton membrane for dialysis |
Eppendorf 5417C Centrifuge | Marshall Scientific | EP-5417C | centrifuge |
Myblock Mini Drybath | Benchmark Scientific | BSH200 | drybath |
FreeZone Plus 6 Liter Cascade Console Freeze Dry System | Labconco | 7934020 | lyophilizer |
all priers and probes | IDT | custom | RT-LAMP primers and probes |
dNTP set | Bioline | BIO-39049 | |
Deoxyuridine Triphosphate (dUTP) | Promega | U1191 | |
Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase | New England Biolabs | M0538L | enzyme |
WarmStart RTx Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0380L | enzyme |
RNase Inhibitor, Murine | New England Biolabs | M0314L | enzyme |
Antarctic Thermolabile UDG | New England Biolabs | M0372L | enzyme |
50bp DNA Step Ladder | Promega | G4521 | marker |
LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche Applied Science | 4729692001 | real-time RT-LAMP analysis |