Summary
In dieser Arbeit beschreiben wir Protokolle, um die Rolle der extrazellulären Vesikel (EVs) veröffentlicht durch Plasmodium Falciparum infizierten Erythrozyten zu untersuchen. Insbesondere konzentrieren wir uns auf die Wechselwirkungen von EVs mit Endothelzellen.
Abstract
Malaria ist eine lebensbedrohliche Krankheit, verursacht durch Plasmodium -Parasiten, mit p. Falciparum als auf dem afrikanischen Kontinent verbreitet und verantwortlich für die meisten Malaria-Todesfälle weltweit. Mehrere Faktoren einschließlich der Parasit Sequestrierung in Geweben, vaskuläre Dysfunktion und Entzündungsreaktionen beeinflussen die Entwicklung der Krankheit bei Menschen mit Malaria infiziert. P. Falciparum-infizierten roten Blutkörperchen (iRBCs) lösen kleine extrazelluläre Vesikel (EVs), enthält verschiedene Arten von Fracht-Moleküle, die Pathogenese und zelluläre Kommunikation zwischen Parasiten und Host zu vermitteln. EVs werden effizient durch Zellen aufgenommen in denen sie ihre Funktion modulieren. Hier besprechen wir Strategien, um die Rolle der EVs in Parasit-Wirt-Interaktionen. Zunächst beschreiben wir eine einfache Methode für die Kennzeichnung und Nachverfolgung EV Internalisierung von Endothelzellen, mit einem grünen Zelle Linker Farbstoff. Zum anderen berichten wir über eine einfache Methode zur Durchlässigkeit über eine Monolage Endothelzellen messen mithilfe von Eindringmittel beschrifteten Dextran. Schließlich zeigen wir, wie die Rolle der kleine nicht-kodierende RNA-Moleküle in Endothelzellen Funktion zu untersuchen.
Introduction
Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation gab es 212 Millionen neue Fälle von Malaria im Jahr 2015 weltweit und rund 429.000 Menschen starben, vor allem Kinder unter fünf Jahren Alter1. Die Mechanismen, die schwere Krankheit, die oft mit vaskuläre Dysfunktion assoziiert wird, bleiben unklar2. Plasmodium- iRBCs absondern, kleine Bi-Lipidmembran Sphären als extrazelluläre Vesikel (EVs) bekannt. Es ist bekannt, dass diese EVs den Infektionsprozess und die Host-Immunantwort auf eine Infektion potenziell relevant sind; jedoch ist wenig bekannt über die genaue Funktion von diesen kleinen Vesikeln in Malaria-Infektion3. Es ist möglich, dass sie zwei wichtige Rollen spielen: auf der einen Seite könnte sie zur Pathogenese beitragen, durch die Aktivierung von Makrophagen4,5; und auf der anderen Seite könnten sie zellulare Kommunikation zwischen Parasiten und zwischen Parasiten und Host6,7vermitteln. In der Tat können Parasiten Proteinen oder Nukleinsäuren untereinander über EFD übertragen. Z. B. Trypanosomen Trypanosomen Rhodesiense EVs Virulenzfaktor Serum Resistance-Associated (SRA) zu übertragen und kann gezielt andere T. Trypanosomen und Host Erythrozyten-8. Darüber hinaus kommunizieren p. Falciparum- iRBCs zwischen einander durch die Übertragung von Nukleinsäuren im EFD. Dadurch können die Parasiten zu optimieren und das Wachstum zu synchronisieren. In der Tat EVs möglicherweise wichtiger Regulator der Gametocyte Umwandlung, und somit dazu beitragen, die Regelung der Übertragung Stufe7.
Nicht nur tun EVs regulieren die Parasiten, sie vermitteln auch Parasit-Wirt-Interaktionen. Wir haben kürzlich entdeckt, dass EVs aus iRBCs Host-abgeleitete Micro-RNAs (MiRNAs; kleine RNA-Spezies im Bereich von 21-25 Nukleotide9) enthalten, die von menschlichen Endothelzellen aufgegriffen wurden. Die MiRNAs in der EVs bilden eine stabile komplexe mit Ago2 (ein Mitglied des RNA-induced silencing complex), die einmal an den Empfängerzellen geliefert ist in der Lage, gezielt Genexpression zum Schweigen zu bringen und die Auswirkungen auf die Barriereeigenschaften der Zellen10. Standard-Protokolle wurden entwickelt, um die Funktion des EFD zu untersuchen. Hier beschreiben wir zunächst ein Protokoll, das fluoreszierende Kennzeichnung von EVs zu untersuchen, deren Aufnahme durch Empfängerzellen ermöglicht. Mithilfe einer confocal Mikroskop ist es darüber hinaus möglich, die EV Schicksal innerhalb der Zelle zu verfolgen. Einige Leuchtstofffärbungen können verwendet werden, um EVs zu verfolgen. Die Amin-Reaktivfarbstoffen, 5-(and-6)-Carboxyfluorescein Diacetat Succinimidyl Ester (CFSE-) und Calcein-AM werden Leuchtstoffröhren einmal im Inneren der Bläschen. Wir bevorzugen die amphiphile Label, PKH, weil es ein heller und gleichmäßiger Signal gibt. Dieser Ansatz bietet wichtige Informationen, um die Wechselwirkungen zwischen EVs und Empfängerzellen verstehen. Während in einigen Fällen EVs an der Oberfläche der Zellen zu binden, werden einige Bläschen schnell aufgegriffen. Nach Aufnahme liefern EVs ihre Fracht an den Zellen, in denen sie ihre regulatorische Funktionen ausüben.
Hier beschreiben wir ein Protokoll, um die Barriere-Funktion der Endothelzellen in-vitro- messen durch die Übertragung von einem fluoreszierenden Dextran durch eine zelluläre Monolage zu quantifizieren. Empfindlicher Tracer können z. B. radioaktiven Marker verwendet werden. Sie erfordern jedoch besondere Sicherheitsvorkehrungen für den Einsatz. Andere Tests bestehen, um die in-vitro- Barriere-Funktion wie Transendothelial elektrischen Widerstand (TEER), zu messen, die engen Kreuzung Integrität misst. Schließlich visualisieren ZO-1, eine tight Junction Proteins durch Immunfluoreszenz ermöglicht Beurteilung der Widerstandsfähigkeit gegen enge Kreuzung als gut10. Da die EVs komplexen und heterogenen Entitäten enthält mehrere Ladungen mit möglichen regulatorischen charakteristisch sind, ist es sinnvoll, eine spezifische RNA um seine Wirkung auf die Empfängerzelle studieren overexpress. Deshalb definieren wir auch eine Protokoll, die darauf abzielt, stabilen Zelllinien mit dem Ausdruck der MiRNA Interesse10zu generieren.
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Protocol
Menschlichen Erythrozyten stammen aus dem Blut von gesunden Spendern, gemäß den Richtlinien des AGEK (swissethics.ch).
Hinweis: P. Falciparum Parasit Kulturen (3 7) und EV Produktion waren zuvor beschrieben in Mbagwu, Et Al. 11 da p. Falciparum ein menschlicher Erreger handelt, wenden Sie sich an die örtlichen Vorschriften Handhabung. Die Kulturen aufbewahrt werden sterile die gesamte Zeit.
(1) Fluoreszenz Kennzeichnung des EFD
Hinweis: Das folgende Verfahren nutzt die Kennzeichnung Technologie, einen grünen Fluoreszenzfarbstoff (PKH67) stabil zu integrieren mit großen aliphatischen Schwänzen in der Lipid-Region der EV-Membran. Die Reaktion erfolgt in einem 200 µL letzte Band mit einer Endkonzentration von 20 µM von PKH67 Färbung. Führen Sie alle Schritte bei Raumtemperatur (20-25 ° C)
- Platz 100 µg des EFD in 1 mL PBS in einem Microcentrifuge Schlauch.
- Zentrifugieren der EVs in einem Microcentrifuge Schlauch mit maximaler Geschwindigkeit (20.000 x g) für 7 min zu Pellets.
Hinweis: Da im Rahmen des EFD Hemozoin vorliegt, ist ein rot-dunkel bräunlicher Pellet hinzuweisen. Wenn der Überstand rötlich ist, haben die EVs lysiert. - Aspirieren Sie nach Zentrifugation überstand sorgfältig, um zu vermeiden, entfernen EVs.
Hinweis: Minimieren Sie die Menge der verbleibenden Puffer vorhanden ist, bevor resuspending EVs im Verdünnungsmittel C um Reproduzierbarkeit und Effizienz der Färbung zu erhöhen. - Aufschwemmen EV Pellet in 100 µL Verdünnungsmittel C (2 X EV Suspension) und sanft pipettieren, komplette Dispersion zu versichern.
- Bereiten Sie einen neuen Microcentrifuge Schlauch und 100 µL des Verdünnungsmittels C. Vortex gut mischen fügen Sie 4 µL der PKH67 ethanolische Farbstofflösung hinzu. Bereiten Sie diese 2 X Farbstofflösung (40 µM) unmittelbar vor der Färbung.
Hinweis: Um zu vermeiden, heterogene Färbung, fügen Sie die PKH67 ethanolische Farbstofflösung direkt zum EV Pellet. - Kombinieren Sie schnell, die 100 µL 2 X EV Suspension (Schritt 1.4) mit 100 µL 2 X Farbstofflösung (Schritt 1.5). Dann mischen Sie die Probe durch Pipettieren nach oben und unten 10 Mal.
- Inkubieren Sie die EV/Farbstoff Suspension aus Schritt 1.6 für 5 min geschützt vor Licht und Mischung von vortexen 3-4 Mal während der Inkubation 5 min.
Hinweis: Inkubation der EV/Farbstoff Suspension für längere Zeiten bietet keinen Vorteil, denn die Färbung so schnell. - Stoppen Sie die Färbung Reaktion durch Zugabe von ein gleiches Volumen (200 µL) des Serums zu und inkubieren Sie für 1 min zur Bindung von überschüssigen Farbstoff zu ermöglichen.
Hinweis: Vor dem Anhalten der Färbung, zum Abbau des Serums von EVs durch Zentrifugation bei 20.000 x g für 20 min. - 3 Mal mit PBS waschen und Spin-down bei 20.000 x g für 5 min. Aufschwemmen der EVs in 100 µL PBS, eine Endkonzentration von 1 µg/µL zu erreichen.
2. visualisieren Sie Aufnahme des EFD konfokalen Mikroskopie
Hinweis: Das folgende Protokoll beschreibt die Verfolgung von EV Internalisierung von Endothelzellen auf Glasdeckgläser angebaut. Die Endothelzellen sind semi-verewigt menschlichen Knochenmark Endothelial Zellen wie in12beschrieben.
- Arbeiten in einer sterilen Umgebung, Mantel Deckgläsern mit einem Überschuss von 0,01 % Poly-L-Lysin für 10 min bei Raumtemperatur (RT).
- Aspirieren Sie die Poly-L-Lysin-Lösung und lassen Sie Deckgläsern vollständig trocknen.
- Führen Sie eine tragfähige Endothelzellen Zählung verwenden Trypan blau Ausgrenzung und eine Hemocytometer.
- 1 x 105 Endothelzellen in 1 mL der komplette Endothelial Zelle Wachstumsmedium, enthält die Ergänzung-Mischung, um die Poly-L-Lysin-beschichtete Deckgläsern und lassen die Zellen wachsen zu einem monomolekularen Film zu übertragen.
Hinweis: Das Medium enthält Wachstumsfaktoren, die Zellen zu einem monomolekularen Film bilden und tight Junctions bilden können. - Sobald die Zellen einer monomolekularen Film bilden, sorgfältig aspirieren Sie das Medium und 1 mL frisches Medium, die Zellen zu waschen. Wiederholen Sie noch einmal waschen. Fügen Sie 50 µg des EFD PKH67 beschriftet und 4 h inkubieren.
Hinweis: Um den optimalen Zeitpunkt für die Aufnahme zu finden, kann ein zeitlichen Verlauf erfolgen. - Aspirieren Sie nach 4 h das Medium, und waschen Sie die Zellen 3 Mal mit PBS, Exzess und ungebundenen EVs zu entfernen. Befestigen Sie die Zellen mit 3 % Paraformaldehyd Lösung mit PBS-Puffer für 15 Minuten.
Hinweis: Methanol kann bei der Fixierung Aktin stören; Daher empfiehlt es sich, jede Methanol, Fixiermittel oder andere Lösungsmittel Fixiermittel enthalten zu vermeiden. Es empfiehlt sich, frei von Methanol Formaldehyd als Fixiermittel verwenden. - Waschen Sie die Zellen 3 Mal mit PBS. Fügen Sie sorgfältig 250 µL von 0,1 % Triton x-100 mit PBS-Puffer für die Zellen permeabilize. 5 min bei RT inkubieren.
- Waschen Sie 3 Mal mit PBS. Fügen Sie 400 µL blocking-Puffer (5 % BSA mit PBS-Puffer) für 30 min bei RT, unspezifischen Bindung zu blockieren.
- Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS. Bereiten Sie die Färbelösung durch Verdünnung 5 µL der Phalloidin Vorratslösung in 200 µL PBS/1% BSA pro jedes Deckglas. Pipettieren 200 µL der Färbelösung auf das Deckglas und 20 min bei RT inkubieren
- Waschen Sie 3 Mal mit PBS. Counterstain die DNA für 30 s mit Hoechst 33342 auf eine Endkonzentration von 2 µg/mL in 200 µL PBS.
- Waschen Sie 2 x das Deckglas durch Zugabe von 400 µL PBS. Vorsichtig das Deckglas mit Zange greifen und auf der Oberseite einen Tropfen Antifade Montage Medien auf einen Objektträger zu invertieren. Entfernen Sie vorsichtig die überschüssige Medien mit einem Tuch und versiegeln Sie jede Seite mit Nagellack.
- Lagern Sie die Folien bei 4 ° c lichtgeschützt
- Visualisieren Sie die Zellen mit einem confocal Mikroskop am Laser Erregungen 405, 488 und 543 nm und einer 63 X 1,3 NA Öl Ziel mit fluoreszierenden Emissionen bei 450-470 nm (blau), 505-530 nm (grün) und 620 nm.
Hinweis: Typische F-Aktin Färbung Ergebnisse sind in Abbildung 1gezeigt.
(3) Endothelzellen Durchlässigkeit
Hinweis: Endothelzellen Durchlässigkeit wird durch die Messung der Übertragung von Rhodamin B erfolgt-Dextran (durchschnittliche MW 70.000) über die Endothelzellen Monolage beurteilt. Dextran bietet ein ausgezeichnetes Werkzeug zur vaskulären Permeabilität zu studieren.
- Graf tragfähige Endothelzellen mit 0,4 % Trypan blau Ausgrenzung und eine Hemocytometer.
- Platte die Endothelzellen bei einer Dichte von 0,6 x 105 Zellen bis Mündung in 24-Well-Zellkultur-Einsätze (0,4 µm Porengröße) und lassen Sie ungestört für mindestens 5 Tage, differenzierte Monolagen zu bilden. Aktualisieren Sie das Medium jeden zweiten Tag.
- Sobald die Zellen einer Monoschicht erreichen, laden die EVs (50 µg in 1 mL) auf die obere Kammer. Fügen Sie die Rhodamin-Dextran zum oberen Brunnen in einer Endkonzentration von 20 mg/mL. Inkubation der Zellen bei 37 ° C mit 5 % CO2.
- Überwachen Sie die Übertragung von fluoreszierenden Dextran nach unten gut durch Messung der Fluoreszenzemission von 40 µL Medium Aliquote. Richten Sie den Multilabel Mikrotestplatte Leser auf 544 nm Anregung und 590 nm Emission für Messungen.
Hinweis: Die Menge an diffusen Dextran kann mit Kalibrierkurven gegründet mit der Stammlösung quantifiziert werden. Darüber hinaus können kinetische Experimente durchgeführt werden, durch das Entfernen von kleiner Proben des Mediums Außenkammer in einen zeitlichen Verlauf (Abbildung 2). Auch ohne Behandlung wird die Dextran durch die Zelle Monolage diffundieren.
4. bestimmen Sie Puromycin Empfindlichkeit
Hinweis: Vor transducing die Zelllinien mit Lentivirus, ist es wichtig, die Kill-Kurve eines ausgewählten Arzneimittels für diese bestimmte Zelle Zeile zu bestimmen. Zur Bestimmung des Mindestbetrag der Wirkstoffkonzentration notwendig, alle Zellen zu töten, eine Dosis-Antwort-Experiment mit inkrementellen Dosen des Medikaments ausgewählten durchführen. Weil jede Zeile Säugetier-Zelle verfügt über eine andere Empfindlichkeit vor dem experimentieren, sollte die optimale Konzentration des Antibiotikums bestimmt werden, durch die Entwicklung der Kill-Kurve-Titration wie unten aufgeführt.
- Zählen Sie die Zellen mit den Hemocytometer. Aufschwemmen der Endothelzellen in einer Konzentration von 1 x 105 Zellen/mL in komplette Endothelial Zelle Wachstum-haltigem Medium der Supplement-Mix.
- Platte 1 x 104 LiPo-Zellen in einer 96-Well-Platte in einem Endvolumen von 100 µL des Mediums Endothelial Zelle Wachstum.
- 100 µL der Antibiotika zu einer Konzentration von 0,1-10 µg/mL-haltigem Medium hinzufügen (siehe Abbildung 3).
- Die Zellviabilität alle 2 Tage unter einem Lichtmikroskop mit einem 20 X Objektiv zu prüfen. Kultur der Zellen für 10-14 Tage und das Medium mit Puromycin alle 2-3 Tage je nach Zellwachstum zu ersetzen.
- Fügen Sie 10 µL/Well MTS Reagenz in jede Vertiefung, Mischung, und 4 h bei 37 ° C im standard Kulturbedingungen inkubieren.
- Schütteln Sie die Platte kurz in einen Shaker geben und Messen Extinktion von behandelten und unbehandelten Zellen mit einem Teller Reader auf 490 nm (Abbildung 3).
(5) Transduktion von Endothelzellen mit Lentivirale Vektor
- Platte 1 x 105 Endothelzellen in 1 mL der kompletten Medium am Vortag Transduktion. Führen Sie Transduktion, wenn die Zellen 50-80 % Konfluenz erreicht haben.
- Tauen Sie die Lentivirus auf Eis auf, und machen Sie Aliquote der viralen Bestände, Frost-Tau-Zyklen zu vermeiden. Spin-down das Material bei 200 X g für 30 s in Röhren vor dem öffnen um Verschütten zu vermeiden.
- Die Zellen in einer Endkonzentration von 8 µg/mL Hexadimethrine Bromid hinzufügen.
Hinweis: Hexadimethrine Bromid hilft die Transduktion Effizienz, jedoch in einigen Fällen für die Zellen giftig sein könnte. Daher sollte die optimale Konzentration bestimmt werden, durch die Durchführung einer Tötung Kurve vor der Transduktion. - Schwenken Sie die Platte vorsichtig mischen. Fügen Sie die entsprechende Menge der Viruspartikel (zwischen 0,5-2 x 106 Teilchen) am geeignet Multiplizität der Infektion (MOI) und wirbeln die Platte vorsichtig für 30 s zu mischen.
- Zentrifugieren der Zelle-viralen Partikel Mix in der Zentrifuge bei RT für 45 min bei 300 X g zur Steigerung der Effizienz der Transduktion. Über Nacht inkubieren Sie die Zelle Viruspartikel Mischung bei 37 ° C.
- Entfernen Sie vorsichtig das virale Partikel-haltigen Medium und entsprechend entsorgen. Ersetzen Sie es mit frischen, vorgewärmten komplette Kulturmedium.
- Starten Sie die Auswahl mit Puromycin am zweiten Tag: das Medium zu entfernen und ersetzen es durch frisches Medium mit der richtigen Konzentration von Puromycin wie zuvor im Abschnitt 4 (Abbildung 3).
- Zellen nach Puromycin Auswahl zu ernten und RNA mit einer RNA Isolierung Kit nach den Anweisungen des Herstellers zu isolieren.
- Ausführen cDNA Synthese mit dem ausgewählten MiRNAs mit Hilfe einer reversen Transkription kit (siehe die Tabelle der Materialien).
- Die qPCR-Reaktion nach der zitierten Protokoll13eingerichtet.
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Representative Results
Hier beschreiben wir Protokolle untersuchen die Wechselwirkungen des EFD mit Wirtszellen. Die Aufnahme von Eindringmittel beschrifteten EVs wird durch konfokale Mikroskopie (Abbildung 1) überwacht. Endotheliale Zellen nehmen effizient EVs, aber die Inkubationszeit mit EVs optimiert werden kann, um die Aufnahme zu verfolgen. Färben Sie für eine bessere Lokalisierung der EVs in den Zellen Actin mit Phalloidin. Als Nächstes verwenden wir eine Filtermembran, auf dessen Spitze eine Monolage von Endothelzellen wächst. Rhodamin B erfolgt-Dextran ist auf die obere Kammer der Filtermembran angewendet und dann wird die Durchlässigkeit der endothelialen Monolage durch Überwachung des Transfers von fluoreszierenden Dextran in der unteren Kammer (Abbildung 2A) gemessen. In der Regel ist die Durchlässigkeit der endothelialen Zellen nach Inkubation mit zunehmender Menge des EFD (Abb. 2 b) betroffen. Es ist wichtig, wachsen die Zellen für mehrere Tage, um sicherzustellen, dass sie einen monomolekularen Film sonst der Farbstoff schnell verbreiten wird durch die Brunnen bilden werden. Es ist wichtig zu beachten, dass auch ohne Behandlung der Dextran langsam durch die Zelle Monolage verbreiten wird.
Micro-RNAs sind Schlüsselkomponenten des EFD und nach Übergabe an den Empfängerzellen, sie regulieren Genexpression. Um speziell die Rolle von MiRNAs zu untersuchen, ist es sehr nützlich, um sie in die Empfängerzelle Linie overexpress. Hier beschreiben wir, wie MiRNAs in endothelialen Zellen transduzieren. Der erste Schritt besteht aus die Konzentrationsbestimmung von Puromycin, die endotheliale Zellen tötet, um stabil ausgestrahlt (Abb. 4A) markieren. Schließlich kann das Niveau der Ausdruck der MiRNAs gesteuert und durch qPCR (Abbildung 4 b) validiert.
Abbildung 1: EVs werden von Endothelzellen aufgegriffen. Gereinigte EVs wurden in grün mit PKH67 und inkubierten für 4 h mit einer Monoschicht von Endothelzellen beschriftet. Unbehandelte endotheliale Zellen dienen als Negativkontrolle. Nach dem umfangreichen waschen um ungebundene EVs zu entfernen, wurden die Zellen mit Phalloidin, Aktin (rot) zu beflecken und Hoechst 33342 Nucleus (blau) Fleck gebeizt. Die Zellen wurden von konfokalen Mikroskopie beobachtet. Bilder wurden mit einem Laser confocal Mikroskop und 63 x 1.3 NA Öl Ziel. Hoechst 33342 freut sich bei 405 nm und mit Emissionen gesammelt bei 450-470 nm (blau); PKH67 freut sich auf 488 nm, Emissionen gesammelt bei 505-530 nm (grün); und Phalloidin-594 freut sich auf 543 nm, Emissionen gesammelt bei 620 nm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Auswirkungen der EV-Aufnahme auf endotheliale Barriere. (A) schematische Darstellung der Diffusion von Rhodamin beschriftet Dextran: Endothelzellen sind gewachsen bis Mündung an der Oberseite eine Filtermembran, fluoreszierende Dextran gilt für die obere Kammer und im Laufe der Zeit durch die Membran diffundiert. Die Wirkung des EFD auf Durchlässigkeit bemisst sich nach der Zugabe des EFD, die obere Kammer durch die Messung der Rate der Diffusion von Dextran in der unteren Kammer. (B) eine zunehmende Menge an EVs sind mit endothelial Zellen inkubiert. Für Messungen der Durchlässigkeit ermöglicht die Übertragung von Rhodamin beschriftet Dextran durch eine Trans-Brunnen-Membran im Laufe der Zeit. Durchlässigkeit auf die endotheliale Schicht wird nach 2 h Inkubation mit 50 und 100 µg/mL des EFD deutlich erhöht. Daten stellen bedeuten (± SEM) aus 3 versuchen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Titration von Puromycin. Puromycin (10 mg/mL)-Stammlösung wird in RPMI 1640 ergänzt mit 10 % Hitze-inaktivierten (56 ° C, 30 min) fetalen Kälberserum, 2 mM Glutamin, 100 U/mL Penicillin/Streptomycin 1 mM Natrium Pyruvat verdünnt. Insgesamt 15 µL ist bis 10 mL des Mediums im Rohr A. hinzugefügt. Dann 7,5 mL der Lösung von Rohr A zu 2,5 mL RPMI Rohr B. gemischt Zu guter Letzt 100 µL der Verdünnung werden hinzugefügt, 100 µL der Zellen, eine Endkonzentration von 7,5 µL/mL, 5,62 µL/mL und so weiter zu geben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Generierung von endothelial Zellen überexprimiert miR451a. (A) Ermittlung der Tötung Kurve von Puromycin auf Endothelzellen. Endotheliale Zellen wurden mit Puromycin bei steigenden Dosen inkubiert. Die Tragfähigkeit wurde nach 72 h von MTS-Assay gemessen. Die Daten stellen den Mittelwert (± SEM) eines repräsentativen Experiments. (B) RNAs aus endothelial Zellen überexprimiert miR451a oder eine Negativkontrolle wurden geerntet und das miR451a-Protokoll wurde durch Real-Time PCR quantifiziert. qPCR Ergebnisse sind durch die 2-Ct-Methode mit U6 als Haushälterin gen normalisiert und ausgedrückt (± SEM) bedeuten (n = 3 Experimente). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Einige Parasiten, einschließlich Toxoplasma, Trypanosomen und Leishmanien Trichomonas auslösen die Freigabe der EVs von der infizierten Wirtszelle. Je nach Erreger können freigegebene EVs vermitteln zelluläre Kommunikation zwischen den Parasiten6bzw. der Host Immunantwort modulieren. Jedoch gibt es wenig Hinweise darauf, wie diese kleinen Bläschen zu Malaria Krankheit beitragen. Hier haben wir mehrere Möglichkeiten, um die Funktion des EFD bei Plasmodium Infektion untersuchen beschrieben. Zum Beispiel kann die Aufnahme von EVs von Empfängerzellen in Vivo effizient durch Beschriften sie mit den PKH67 Leuchtstofffärbung überwacht werden. Mehrere Steuerelemente müssen durchgeführt werden, um die Spezifität der Kennzeichnung zu gewährleisten. Es ist wichtig zu beachten, dass einmal mit dem Verdünnungsmittel C gemischt, die PKH67 Farbstoff Form Aggregate tendenziell, und es daher notwendig ist, ein Steuerelement mit dem Farbstoff allein ohne EVs die unspezifische Färbung bestimmen. Konfokale Mikroskopie ist die Methode der Wahl zur Unterscheidung Bläschen an der Oberfläche gebunden und durch den Empfängerzellen wirklich verinnerlicht. Darüber hinaus bietet es ein hervorragendes Werkzeug zum Nachverfolgen und überwachen die Anzahl der Bläschen, die von den Zellen aufgenommen. Unklar bleibt allerdings, wie EVs in den Empfängerzellen14verarbeitet werden; Durchführung von daher einen zeitlichen Verlauf mit Zeit-Punkte 2, 4 und 8 h, möglicherweise sehr nützlich, um die optimalen Bedingungen für die Aufnahme zu bestimmen. Die Zugabe der subzellulären Fach Marker lässt sich der EVs in den Zellen zu verfolgen von konfokalen Mikroskopie. EV Aufnahme nachweislich Membranfusion per Endozytose15auftreten. Die Fusion kann durch Kennzeichnung EVs mit Octadecyl Rhodamin B (R18) überwacht werden. Die Verschmelzung des EFD mit der Zellmembranen führt zu einer Verwässerung der R18, führt zu einem Anstieg der Fluoreszenz16. Aufnahme des EFD durch Endozytose kann studiert werden, mithilfe von spezifischen Inhibitoren von Aktin, Mikrotubuli und Dynamin10.
Um die Physiologie des EFD zu studieren, ist es möglich, beschriften Sie die iRBCs direkt mit der PKH Farbstoffe und Co Kultur iRBCs mit Endothelzellen. Das Problem hierbei ist, dass die Zellen unterschiedliche Medien benötigen und Gaszusammensetzungen und die Menge der EV-Transfer könnte niedrig sein. Darüber hinaus können vesikuläre verschmolzen mit einem fluoreszierenden Proteinen in den Spender Zellen in Vitro und in Vivoausgedrückt werden. Allerdings wurde so weit es nicht mit iRBCs getestet
Infizierte Erythrozyten sind Cytoadherent zu den Microvasculature des Gehirns, in einem Prozess gedacht, um zu zerebralen Malaria17verantwortlich sein. Daher ist die Übertragung von Parasiten Material über EFD Endothelzellen und daher Gefäßfunktion18beeinflussen. Der in-vitro- Test hier beschrieben wird, bietet eine einfache Möglichkeit, einige der grundlegenden Eigenschaften der endothelial Zellen, wie zum Beispiel seine Durchlässigkeit19zu untersuchen. Zusätzliche Tests wie TEER oder Immunostaining mit ZO-1 bieten weitere Informationen über die engen Kreuzung Integrität10.
Darüber hinaus erweist die in-vitro- Modell sich ein mächtiges Werkzeug, um die molekularen Mechanismen hinter der zellulären Kommunikation zwischen Parasiten und Wirtszellen zu studieren werden. Neben der Aufnahme ermöglicht dieses Setup die Untersuchung der molekularen Mechanismen in diesen Prozess einbezogen. Zum Beispiel haben wir die Übertragung der miR451a an den Akzeptor-Zellen durch Real-Time PCR und Fluoreszenz in Situ Hybridisierung überwacht. Darüber hinaus beschreiben wir Zelllinien überexprimiert eine besondere MiRNA, um die Rolle von diesen kleinen RNA in Gefäßfunktion10direkt ansprechen zu generieren. Jedoch sollte mehrere Steuerelemente ausgeführt werden, einschließlich Tests nicht ausgestrahlt Zellen, da die Signalweiterleitung selbst die zelluläre Funktion beeinträchtigen könnten. MiRNA-Inhibitoren ist darüber hinaus lässt sich die Wirkung der MiRNAs neutralisieren.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Studie wurde von der Novartis-Stiftung für medizinische und biologische Forschung (um PYM), der Gottfried und Julia Bangerter-Rhyner-Stiftung (für MW und PYM) und den Forschungspool der Universität Freiburg (um PYM) teilweise finanziell unterstützt. Weitere Beihilfen gehören die Schweizer Regierung Excellence Scholarships für ausländische Wissenschaftler (zur KAB und SM). Wir danken Isabelle Fellay und Solange Kharoubi Hess für technischen Support.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Diluent C | Sigma-Aldrich | G8278 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| PBS | ThermoFisher - Gibco | 10010023 | |
| Phalloidin CF594 | Biotium | #00045 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Rhodamine B isothiocyanate–Dextran | ThermoFisher | R9379-250MG | |
| Insert with PET membrane transparent Falcon for plate 24 wells | Falcon | 353095 | |
| Endothelial Cell Growth Medium MV | Promocell | C-22020 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P9620-10ML | |
| MTS Cell Proliferation Colorimetric Assay Kit | Biovision | K300-500 | |
| hexadimethrine bromide | Sigma-Aldrich | 107689-10G | |
| MISSION Lenti microRNA, Human hsa-miR-451a | Sigma-Aldrich | HLMIR0583 | |
| MISSION Lenti microRNA, ath-miR416, Negative Control 1 Transduction Particles | Sigma-Aldrich | NCLMIR001 | |
| MISSION Lenti microRNA, Human | Sigma-Aldrich | NCLMIR0001 | |
| Leica TCS SP5 | Leica Microsystems | ||
| miRNeasy mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 1000 reactions | ThermoFisher | 4366597 | |
| hsa-mir-451a RT/750 PCR rxns | ThermoFisher | 001141 | |
| U6 snRNA | ThermoFisher | 001973 | |
| TaqMan Universal Master Mix II, with UNG | ThermoFisher | 4440038 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | ThermoFisher | 4376600 |
References
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