Summary

Dissection multi-signalisation Complexes protéiques par Purification d’affinité de complémentation bimoléculaire (BiCAP)

Published: June 15, 2018
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Summary

Cet article décrit le protocole pour la Purification d’affinité de complémentation bimoléculaire (BiCAP). Cette nouvelle méthode facilite l’isolement spécifique et la caractérisation de la protéomique en aval de toute deux protéines qui interagissent, tandis que hors ONU complexée protéines individuelles ainsi que des complexes formés avec des partenaires de liaison concurrentes.

Abstract

L’Assemblée de complexes protéiques est un mécanisme central qui sous-tendent le règlement de nombreuses voies de signalisation de cellulaire. Un objectif majeur de la recherche biomédicale est déchiffrer comment ces complexes de protéine dynamique agissent pour intégrer les signaux provenant de plusieurs sources afin de diriger une réponse biologique spécifique, et comment cela devient déréglementé dans bien des cas de maladie. Malgré l’importance de ce mécanisme biochimique essentiel, il y a un manque de techniques expérimentales qui peuvent faciliter la déconvolution spécifique et sensible de ces complexes de signalisation moléculaires multiples.

Ici, cette lacune est adressée par la combinaison d’un dosage de complémentation protéique avec une conformation spécifique nanobody, que nous avons appelé bimoléculaire Purification d’affinité de complémentation (BiCAP). Cette nouvelle technique facilite l’isolation spécifique et la caractérisation de la protéomique en aval de n’importe quelle paire de protéines qui interagissent, à l’exclusion des protéines individuelles ONU complexée et complexes qui se forment avec des partenaires de liaison concurrentes.

La technique de BiCAP s’adapte à un large éventail d’essais expérimentaux en aval, et le haut degré de spécificité offerte par cette technique permet plus nuancées enquêtes sur la mécanique de l’assemblage complexe de protéine est actuellement possible à l’aide techniques de purification d’affinité standard.

Introduction

Assemblage complexe de protéine est un processus clé dans le maintien de la spécificité spatio-temporelle de nombreuses signalisation des voies1,2. Bien que la nature essentielle de ce rôle réglementaire est largement reconnue, il y a un manque de techniques expérimentales disponibles à scruter ces complexes. La plupart des études interactomique mettre l’accent sur les interactions avec les protéines individuelles, ou l’enrichissement séquentiel des composants complexes. Nous présentons ici une technique pour l’isolation d’un dimère de protéine spécifique tout en excluant les portions individuelles de la protéines composant, mais aussi les complexes formés avec liant les partenaires3en compétition. Nous avons appelé cette technique bimoléculaire Purification d’affinité de complémentation (BiCAP), telle qu’elle est une combinaison d’un dosage de complémentation de fragment protéique déjà existantes, bimoléculaire complémentation de Fluorescence (BiFC), avec la nouvelle utilisation d’un conformation spécifique nanobody recombinante vers GFP et de ses dérivés (voir Table des matières).

Une analyse de complémentation de fragment de protéine typique se fonde sur l’expression des protéines « appât » et « proie » fusionnés pour fractionner des fragments de reporters comme luciférase,4,5de la β-galactosidase ou protéine fluorescente verte (GFP)6 ( Figure 1 a). Par le biais de l’interaction des protéines appât et proies, les domaines de journaliste de split sont encouragés à replier dans une structure fonctionnelle, qui permet l’interaction de l’appât et de protéines pour être visualisées ou quantifié la proie. BiCAP a été adapté d’une version de cette technique qui fait utiliser des fragments de la variante GFP Venus. Protéine fluorescente complémentation dosages sont une méthode populaire pour la visualisation des interactions protéines-protéines dans une cellule en direct, mais jusqu’à présent ont été limitées à cette un fonction7. BiCAP représente une avancée significative à cet égard, car cette technique permet non seulement pour la visualisation, mais aussi l’isolement et l’interrogatoire de l’interaction protéine-protéine qui en résulte.

Figure 1
Figure 1 : le capital structurel derrière la technique BiCAP. (A) un schéma décrivant l’entité de sécurité derrière l’affichage de complémentation de fluorescence bimoléculaire les protéines « appât » et « proie » marquées par le N-terminal V1 ou V2 C-terminal des fragments de la protéine pleine longueur de Vénus. (B) analyse structurale de l’interface d’interaction (cyan) entre la GFP nanobody (vert) et Vénus recombinée, montrant la position de la V1 (gris) et des fragments de V2 (orange) (APB adhésion 3OGO). Ce chiffre est republié fromCroucher Al3 reproduit avec la permission de l’AAAS. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Le BiCAP technique fait usage de deux fragments non fluorescent de Vénus (nommé V1 et V2), qui associent avec un faible degré d’affinité, à moins qu’une interaction se produit entre leurs partenaires en matière de fusion. Dans ce cas, les domaines deux split replier dans la structure fonctionnelle de la β-baril du fluorophore (Figure 1 b)6. L’innovation majeure de BiCAP provient de l’introduction de la recombinaison nanobody GFP, qui reconnaît un épitope en trois dimensions sur le β-Canon de GFP (et des variantes telles que Vénus) qui n’est présent que sur le fluorophore recombiné et correctement plié ( Figure 1 b)8. Fondamentalement, la GFP nanobody ne lie pas à un des fragments individuels Venus. Ceci facilite l’isolement des dimères de protéine qu’après que les deux protéines ont formé un complexe de leur propre gré, conduisant à des résultats plus représentatives que celles acquises des méthodes qui rendent l’utilisation de chimiquement induite, forcé les interactions9.

BiCAP est une technique puissante qui se concentre spécifiquement sur les complexes de protéines multiples, qui peuvent potentiellement être combinées avec un certain nombre d’applications en aval afin d’améliorer la granularité de notre compréhension du rôle à jouer ces complexes dans la transduction du signal . Elle englobe également la caractéristique importante de ce qui permet la visualisation des interactions de protéine in situ. A ce jour, BiCAP a été démontrée comme une méthode efficace d’analyse de l’interactome des récepteurs tyrosine kinase (RTK) dimères3, mais la capacité d’adaptation de cette méthode signifie qu’il pourra être adopté dans presque n’importe quel contexte d’interaction de protéine.

Protocol

1. plasmide clonage NOTE : Pour générer des vecteurs de plasmide avec les balises V1 ou V2 fusionnées à l’extrémité N-terminale ou l’extrémité C-terminale du gène d’intérêt, les vecteurs de destination BiFC ont été déposés avec Addgene [tag N-terminale : pDEST-V1-ORF (#73635), pDEST-V2-ORF (#73636). C-terminal balise : pDEST-ORF-V1 (#73637), pDEST-ORF-V2 (#73638)]. Le gène/s d’intérêt devront être dans le clonage des vecteurs d’entrée compatible (par exemple,…

Representative Results

Suite à l’utilisation du clonage de recombinaison pour générer de V1 et V2 tag des gènes d’intérêt avec les plasmides de pDEST BiFC, co transfection des deux plasmides contenant une paire d’interaction des protéines se traduira par la génération d’un signal fluorescent Venus après environ 8 à 24 heures. En l’absence d’un signal positif, qu’il est possible que l’interaction de la protéine ne peut-être pas se produire grâce au choix d’une lignée cellulaire, un…

Discussion

BiCAP est une méthode puissante pour isoler les dimères de protéine spécifique tout en excluant les composants individuels et leurs concurrents de partenaires de liaison3. BiCAP repose sur l’adaptation d’un dosage de complémentation protéique de fluorescence appelé BiFC6. Les méthodes existantes, y compris les essais de ligature BiFC et de proximité, ont été largement utilisés pour visualiser et quantifier les interactions de protéine dans des cellules viva…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Entiereté est un camarade de NSW Institut du Cancer et D.N.S était auparavant un Cancer Institute NSW Fellow. Les résultats de la recherche présentées dans ce manuscrit ont été financés par le Cancer Institute NSW (13/RSF/1-02 et 09/CDF/2-39), NHMRC (projet Grant GNT1052963), Science Foundation Ireland (11/GSS/B2157), NSW Office of Science et recherche médicale, les famille Bourse et Mostyn Family Foundation. J.F.H. et R.S. ont été destinataires d’une sentence Postgraduate australien.

Materials

LR Clonase II Plus enzyme Thermo Fisher Scientific 12538120 Recombinase enzyme required for Gateway cloning (Step 1) into pDEST BiFC destination vectors
Proteinase K, recombinant, PCR grade Thermo Fisher Scientific EO0491
14 mL round-bottomed polypropylene tube Corning 352059
Ampicillin Roche Diagnostics Australia 10835242001 Stock solution prepared at 100 μg/mL in distilled water.
Miniprep kit Promega Corporation A1330
Maxiprep kit Life Technologies Australia K2100-07
DMEM Gibco 11995-073
FBS Life Technologies Australia 10099-141
Penicillin/Streptomycin Life Technologies Australia 15070-063
jetPRIME transfection buffer Polyplus 114-15
jetPRIME transfection reagent Polyplus 114-15
PhosSTOP (Phosphatase inhibitor) Sigma-Aldrich 4906837001
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease inhibitor cocktail Roche 11873580001
Cell Scraper Sarstedt 83.1832
GFP-Trap_A Chromotek Gmbh gta-100 GFP nanobody coupled to agarose beads
N-terminal GFP monoclonal antibody  Covance MMS-118P Will detect the V1 tag within the BiFC vectors
C-terminal GFP monoclonal antibody Roche 11814460001 Will detect the V2 tag within the BiFC vectors
Sample buffer Invitrogen NP0008 Supplemented with 1 mL β-mercaptoethanol.
Sequencing grade modified trypsin Promega Corporation V5117h
LoBind microcentrifuge tubes Point of Care Diagnostics 0030 108 116
Iodoacetamide Sigma-Aldrich I1149-5G Prepared at 5 mg/mL in ultrapure water
Trifluoroacetic Acid – Sequanal Grade Thermo Fisher 10628494
3M Empore solid phase extraction C18 disks (octadecyl) – 4.7 cm Thermo Fisher 14-386-2 To prepare stage tips, cut 1 mm disks using an appropriately sized hole punch. Alternatively, pre-prepared stage tips can also be purchased, see below.
C18 Stage Tips, 10 µL bed Thermo Fisher 87782
Formic acid OPTIMA for LC/MS grade 50mL Thermo Fisher FSBA117-50
1.9 μm C18 ReproSil particles Dr. Maisch GmbH r119.aq. Stationary phase particles
Acetonitrile OPTIMA LC/MS grade  Thermo Fisher FSBA955-4
Easy-nLC HPLC  Thermo Fisher
LTQ Orbitrap Velos Pro Thermo Fisher
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 Non-ionic detergent (100%)
DH5α cells Thermo Fisher Heat-shock-competent cells

References

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Hastings, J. F., Han, J. Z., Shearer, R. F., Kennedy, S. P., Iconomou, M., Saunders, D. N., Croucher, D. R. Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). J. Vis. Exp. (136), e57109, doi:10.3791/57109 (2018).

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