Summary

Aislamiento y cultivo de Microglia roedor para promover una dinámica ramifican morfología en medio libre de suero

Published: March 09, 2018
doi:

Summary

Esfuerzos para comprender la función microglial en detalle han impedido por la falta de modelos de cultura microglial que recapitular las propiedades de microglia maduros en vivo . Este protocolo describe un acercamiento aislamiento y cultura diseñado para mantener la supervivencia robusta de microglia altamente ramificados de rata maduro medio definido en condiciones.

Abstract

Microglía representan el 5-10% de todas las células del sistema nervioso central (SNC) y son cada vez más llamar la atención debido a sus contribuciones durante el desarrollo, homeostasis y enfermedad. Aunque los macrófagos han sido estudiados en detalle por décadas, características especializadas de la microglía, los macrófagos residentes de tejido del SNC, se han mantenido en gran parte misteriosa, en parte debido a las limitaciones en la capacidad para recapitular microglial maduro propiedades en la cultura. Aquí ilustramos un sencillo procedimiento para el aislamiento rápido de puro microglia del cerebro de roedores maduros. También describimos las condiciones de cultivo libre de suero que soportan altos niveles de microglial viabilidad con el tiempo. Microglia cultivada bajo estas condiciones del medio definen exhiben elaborados procesos ramificados y comportamiento dinámico de la vigilancia. Ilustramos algunos efectos de la exposición del suero en microglia cultivada y discutir cómo estas culturas sin suero comparan culturas expuestas al suero, así como microglia en vivo.

Introduction

Como los macrófagos de la parenquimia del CNS, microglia interactuar con una amplia gama de circuitos neuronales y gliales redes de señalización. Desempeñan funciones vitales en el desarrollo y homeostasis del cerebro a través de la poda sináptica, separación de células apoptotic y transitorias interacciones con procesos neuronales1,2. Microglia son primeros respondedores a lesiones neurológicas, ampliando sus procesos de largas y delgadas a los sitios de lesión para coordinar las respuestas inflamatorias y limitar el sangrado3,4. Cambios en la morfología de microglial y función son ubicuos en lesiones CNS agudas y crónicas, y microglia exposición altera morfología, localización y expresión de mediadores inflamatorios en una amplia gama de Estados de enfermedad1. Estudios genéticos en humanos indican que las mutaciones que alteran el riesgo de enfermedades neurodegenerativas son a menudo predominantemente o exclusivamente expresadas por microglia del sistema nervioso intacto, apuntando hacia un papel crítico para la microglia en la patogénesis de la enfermedad o progresión de la5 . Dada su prominencia en accidentes y enfermedades, favorecer la comprensión de la biología de microglial es una alta prioridad para el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos.

Han surgido muchos avances fundamentales para la comprensión de la biología de microglial extrapolando mecanismos descubiertos en estudios de otras poblaciones de macrófagos incluyendo métodos de cultivo, perfiles de expresión génica y definiciones funcionales y técnicas / morfológicas Estados. Aunque generalizado macrófago funciones a menudo juegan de manera sorprendente dentro del panorama de la CNS, microglía son altamente especializados, exhiben una morfología ramificada y una firma de expresión de gen único que les diferencia de otros tejidos los macrófagos6. Microglia tienen un linaje que es distinto de la mayoría de los otros macrófagos; colonizar el SNC durante una temprana ola embrionaria de hematopoyesis primitiva y uno mismo-renovar toda la vida, independiente de las contribuciones de hematopoyesis definitiva7. La firma de expresión de gen completamente maduros de microglia adultos no se logra hasta la segunda semana postnatal8. Señales ambientales del tejido circundante juegan un papel importante en el dictado de macrófagos de tejido-específica características6, que en el SNC incluye exposición limitada a factores transmitidos por la sangre por la barrera hemato – encefálica9.

Un obstáculo para comprender plenamente microglial contribuciones a CNS homeostasis y enfermedad es la dificultad de recapitular las propiedades especializadas de microglia madura visto en vivo con células purificadas en vitro. Muchos métodos han sido desarrollados para aislar y microglia intacta de la cultura, pero la mayoría de enfoques dependen de suero para apoyar la supervivencia de la célula. Hemos demostrado que además del suero, que es un reactivo inherentemente variable que contiene una gran variedad de moléculas bioactivas, es particularmente problemático cuando trabajo con microglia ya que promueve una morfología ameboides, incrementa la proliferación, y aumento de fagocitosis9 a menudo visto en vivo cuando microglía están expuestos a factores de sangre después de la interrupción de la barrera blood – brain. De estas métricas, expuestas al suero de las células se asemejan a microglia en lesiones o enfermedades, pero tales alteraciones se reducen cuando microglia se cultivan en el medio de crecimiento definido con CSF-1 (o IL-34), TGF-β, colesterol y selenita.

Este protocolo proporciona información detallada para el cultivo de rata juvenil microglia en condiciones libres de suero, relacionados con la obra recientemente publicada9. Este protocolo se ha racionalizado para las ratas de día postnatal 21-30 (P21 – P30), pero puede ser adaptado para aislar microglia de ratas y ratones de cualquier edad, aunque el rendimiento y la viabilidad general varían dependiendo de la especie y edad del animal. Máximo rendimiento y viabilidad óptima se logra cuando se usa ligeramente inmaduro microglia (~ P9), con rendimientos y viabilidad estrechándose gradualmente a algo de niveles más bajos en animales adultos. Microglía también puede ser aislado de ratones, pero hemos encontrado que las células de rata muestran significativamente mayor rendimientos, viabilidad y la complejidad de la morfología ramificada, en comparación con las células de ratón en cultivos libres de suero. Animales de edad superior a P50 no han sido evaluadas con este protocolo. Este procedimiento de aislamiento de immunopanning ha sido optimizado para reducir al mínimo cambios en perfiles transcripcionales microgliales durante el aislamiento y para maximizar la viabilidad posterior de las células. Usando estas técnicas y formulaciones de los medios de comunicación, cultivos primarios de alta viabilidad pueden mantenerse por semanas. Microglia cultivada bajo estas condiciones presentan una morfología muy ramificada con rápida extensión y retracción de los procesos y relativamente bajas tasas de proliferación. Resaltar la importancia de suero-exposición de estas características y discutir las fortalezas y debilidad de este método en comparación con otros enfoques.

Protocol

Todos los procedimientos que involucran a roedores conforman a las directrices de la Universidad de Stanford, que cumplan con las políticas y las leyes estatales y nacionales. Todos los procedimientos animales fueron aprobados por el Comité Administrativo de la Universidad de Stanford sobre cuidado de animales de laboratorio. Nota: Todas las composiciones solución y buffer son proporcionadas en la Tabla de materiales. 1. prepare una placa de Petri …

Representative Results

Este protocolo describe un método de cultura alta pureza ramificado microglia de ratas juveniles. Resultados similares pueden obtenerse utilizando animales inmaduros, perinatales y adultos, como se explica a continuación. Desde aislamientos celulares suelen incluyen matices sutiles y muchas oportunidades para que las células mueren, usamos puntos de control de calidad para ayudar a determinar el éxito en varios pasos. Normalmente supervisamos suspensiones celulares usando un hemocitó…

Discussion

Porque microglia sirva de centinela de las células inmunes de la CNS, son altamente sensibles a los cambios ambientales; por lo tanto, se requiere gran cuidado para reducir al mínimo las respuestas inflamatorias dentro de las células durante el aislamiento y cultura8. Esto se logra en este protocolo a través de la velocidad y la temperatura. Mantener las células en hielo o a 4 º C siempre que sea posible reduce la activación, por lo que realizará todos los pasos de centrifugación a 4 ° C…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por la Christopher y Dana Reeve Foundation internacional Consorcio de investigación en lesión de la médula espinal, el Dr. Miriam y Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation, la Fundación de JPB, el Instituto Novartis de investigación básica, generosas contribuciones de Vicente y Stella Coates y Damon Runyon Cancer Research Foundation (DRG-2125-12).

Materials

Rat: Sprague-Dawley Charles River Cat# 400
mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42) Bio-Rad Cat# MCA275R Panning: 1:1,000; Staining: 1:500
Goat polycolonal anti-Iba1  Abcam Cat# AB5076 Staining: 1:500
Rabbit polyclonal anti-Ki67  Abcam  Cat# AB15580 Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594 Invitrogen Cat# 11055 Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-goat 488 Invitrogen Cat# A-21203 Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647 Invitrogen Cat# A-31573 Staining: 1:500
Triton-X (detergent in ICC staining) Thermo Fisher Cat# 28313
Heparan sulfate Galen Laboratory Supplies Cat# GAG-HS01
Heparin Sigma  Cat# M3149
Peptone from milk solids Sigma Cat# P6838
TGF-β2 Peprotech Cat# 100-35B
Murine IL-34 R&D Systems Cat# 5195-ML/CF
Ovine wool cholesterol Avanti Polar Lipids Cat# 700000P
Collagen IV Corning  Cat# 354233
Oleic acid Cayman Chemicals  Cat# 90260
11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid Cayman Chemicals  Cat# 20606
Calcein AM dye Invitrogen Cat# C3100MP
Ethidium homodimer-1 Invitrogen Cat# E1169
DNaseI Worthington Cat# DPRFS
Percoll PLUS GE Healthcare Cat# 17-5445-02
Trypsin  Sigma Cat# T9935
DMEM/F12 Gibco Cat# 21041-02
Penicillin/ Streptomycin Gibco Cat# 15140-122
Glutamine Gibco Cat# 25030-081
N-acetyl cysteine  Sigma Cat# A9165
Insulin Sigma Cat# 16634
Apo-transferrin  Sigma Cat# T1147
Sodium selenite Sigma Cat# S-5261
DMEM (high glucose) Gibco Cat# 11960-044
Dapi Fluoromount-G Southern Biotech Cat# 0100-20 
Poly-D-Lysine  Sigma Cat# A-003-E
Primaria Plates  VWR Cat# 62406-456
Name Company Catalog Number Comments
Stock reagents 
Apo-transferrin Reconstitution: 10 mg/mL in PBS
Concentration used: 1:100
Storage: -20°C
N-acetyl cysteine Reconstitution: 5 mg/mL in H2O
Concentration used: 1:1,000
Storage: -20°C
Sodium selenite Reconstitution: 2.5 mg/mL in H2O
Concentration used: 1:25,000
Storage: -20°C
Collagen IV Reconstitution: 200 μg/mL in PBS
Concentration used: 1:100
Storage: -80°C
TGF-b2 Reconstitution: 2 mg/mL in PBS
Concentration used: 1:1,000
Storage: -20°C
IL-34 Reconstitution: 200 μg/mL in PBS
Concentration used: 1:1,000
Storage: -80°C
Ovine wool cholesterol Reconstitution: 1.5 mg/mL in 100% ethanol
Concentration used: 1:1,000
Storage: -20°C
Heparan sulfate Reconstitution: 1 mg/mL in H2O
Concentration used: 1:1,000
Storage: -20°C
Oleic acid/Gondoic acid Reconstitution: Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol
Concentration used: 1:1,000
Storage: -20°C
Heparin Reconstitution: 50 mg/mL in PBS
Concentration used: 1:100
Storage: -20°C
Name Company Catalog Number Comments
Solutions 
Perfusion Buffer Recipe: 50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +)
Comments: Use when ice-cold
Douncing Buffer Recipe: 200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++
Comments: Use when ice-cold
Panning Buffer Recipe: 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++
Microglia Growth Medium (MGM) Recipe: DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite
Comments: Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish.
Collagen IV Coating Recipe: MGM containing 2 μg/mL collagen IV
Myelin Seperation Buffer Recipe: 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2
Comments: Mix well after the addition of  CaCl2 and MgCl2
TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC)  Recipe: MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid
Comments: Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH.

References

  1. Colonna, M., Butovsky, O. Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration. Annu Rev Immunol. 35, 441-468 (2017).
  2. Wu, Y., Dissing-Olesen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. Microglia: Dynamic Mediators of Synapse Development and Plasticity. Trends Immunol. 36 (10), 605-613 (2015).
  3. Lou, N., et al. Purinergic receptor P2RY12-dependent microglial closure of the injured blood-brain barrier. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (4), 1074-1079 (2016).
  4. Haynes, S. E., et al. The P2Y12 receptor regulates microglial activation by extracellular nucleotides. Nat Neurosci. 9 (12), 1512-1519 (2006).
  5. Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), (2017).
  6. Lavin, Y., et al. Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment. Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).
  7. Hoeffel, G., Ginhoux, F. Ontogeny of Tissue-Resident Macrophages. Front Immunol. 6, 486 (2015).
  8. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).
  9. Bohlen, C. J., et al. Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures. Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).
  10. Herz, J., Filiano, A. J., Smith, A., Yogev, N., Kipnis, J. Myeloid Cells in the Central Nervous System. Immunity. 46 (6), 943-956 (2017).
check_url/57122?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Collins, H. Y., Bohlen, C. J. Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium. J. Vis. Exp. (133), e57122, doi:10.3791/57122 (2018).

View Video