Yalıtım ve dinamik bir teşvik etmek kemirgen Microglia kültürünü Morfoloji Serum-Alerjik orta Ramified
Summary
Ayrıntılı olarak mikroglial işlevini anlamak için çaba olgun vivo içinde microglia özelliklerini özetlemek mikroglial kültür modellerin eksikliği tarafından engel. Bu iletişim kuralı sağlam çok ramified olgun sıçan microglia tanımlanan-orta koşullar altında yaşama korumak için tasarlanmış bir yalıtım ve kültür yaklaşım anlatılmaktadır.
Abstract
Microglia tüm merkezi sinir sistemi (MSS) hücreleri % 5-10’u temsil ve geliştirme, homeostasis ve hastalık sırasında önem onların katkıları nedeniyle giderek çizim. Makrofajlar ayrıntılı olarak incelenmiştir rağmen yıl, özel şekil-in microglia, MSS doku yerleşik makrofajlar, kısmen olgun mikroglial özetlemek için yetenek sınırlamaları nedeniyle büyük ölçüde gizemli kalmıştır Kültür özelliklerinde. Burada, saf microglia–dan olgun kemirgen beyin hızlı yalıtım için basit bir yordam gösterilmektedir. Biz de mikroglial canlılık yüksek düzeyde zaman içinde destek serum serbest kültür koşulları tanımlamak. Bu tanımlanan-orta koşullar altında kültürlü Microglia sergi ayrıntılı ramified süreçleri ve dinamik gözetim davranış. Biz kültürlü microglia serum maruz kalma bazı etkileri göstermek ve nasıl bu serum-Alerjik kültürler hem serum maruz kültürler gibi microglia içinde vivokarşılaştırmak tartışıyorlar.
Introduction
CNS parankimi makrofajlar microglia nöronal devreler ve gliyal sinyal ağları geniş bir dizi ile etkileşim. Geliştirme ve homeostasis sinaptik budama, apoptotik hücre Gümrükleme ve nöronal işlemleri1,2geçici etkileşimleri aracılığıyla beynin hayati rol oynarlar. Microglia nörolojik yaralanmaları, erken müdahale uzun, ince süreçlerinin lezyon siteler inflamatuar yanıt koordine etmek ve kanama3,4sınırlamak için uzanan vardır. Mikroglial morfoloji ve işlev değişiklikleri akut ve kronik CNS yaralanmaları her yerde vardır ve Morfoloji, Yerelleştirme ve hastalık Birleşik1çeşitli bir yelpazede inflamatuar aracılar ifade microglia sergi değişmiş. Nörodejeneratif hastalıklar için risk alter mutasyonlar kez ağırlıklı olarak veya sadece hastalık patogenezinde veya ilerleme5 microglia için kritik bir rol işaret olduğu gibi MSS microglia tarafından ifade edilir insan genetik çalışmalar göstermektedir . Yaralanma ve hastalık onların önem dikkate alındığında, mikroglial Biyoloji anlayışı sürdürmek yeni tedavi yaklaşımları geliştirmek için bir yüksek önceliktir.
Mikroglial Biyoloji anlayış için birçok kritik gelişmeler teknikleri ve kültür yöntemleri, gen ifade profilleri ve işlev tanımları da dahil olmak üzere diğer makrofaj nüfus çalışmalarda keşfetti mekanizmaları extrapolating tarafından ortaya çıktığı / morfolojik Birleşik. İşlevler genellikle oynamaya CNS manzara içinde şaşırtıcı şekilde makrofaj Genelleştirilmiş, microglia olmakla birlikte, kendilerini son derece uzmanlaşmış, ramified bir morfoloji ve onları diğer doku dışında setleri benzersiz gen ifade imza sergilenmesi makrofajlar6. Microglia–dan en diğer doku makrofajlar ayrı bir soy var; MSS ilkel hematopoiesis bir erken embriyonik dalga sırasında kolonize ve hayatı, bağımsız olarak kesin hematopoiesis7katkıları boyunca kendini yenilemek. Yetişkin microglia tam olgun gen ifade imza kadar ikinci doğum sonrası hafta8elde değil. Çevreleyen doku çevre ipuçları MSS sınırlı maruz kalma kan – beyin bariyerini9tarafından verilen kan kaynaklı faktörler içeren özel doku makrofaj özellikleri6, dikte içinde önemli bir rol oynamaktadır.
CNS homeostazı ve hastalığı mikroglial katkıları tam olarak anlamak için bir engel olduğunu olgun microglia görülen vivo içinde arıtılmış hücreleri ile özel özelliklerini recapitulating zorluk tüp bebek. İzole etmek için pek çok yöntem geliştirilmiştir ve kültür olduğu gibi microglia ama çoğu yaklaşımlar hücre survival desteklemek için serum güveniyor. Biz doğal olarak değişken bir reaktif biyoaktif molekülleri geniş bir dizi içeren, protozlar bir Morfoloji teşvik çünkü nükleer silahların yayılmasına karşı microglia ile çalışma artış özellikle sorunlu olduğunda, serum, bu ek göstermiştir ve microglia maruz kaldığında faktörlerin kan – beyin bariyerini bozulma sonra bulaşan kan için artan fagositoz9 vivo içinde sık görülen. Bu ölçümler tarafından serum Günese maruz kalan hücreleri microglia yaralanma veya hastalık durumlarında benzer ama tür değişiklikler azalır ne zaman microglia kültürlü CSF-1 (veya IL-34) içeren tanımlanmış büyüme orta, TGF-β, kolesterol ve selenit.
Bu iletişim kuralı Juvenil sıçan microglia kısa bir süre önce iş9‘ a ilgili serum-Alerjik koşullar altında kültür için ayrıntıları sağlar. Bu iletişim kuralı için rats postnatal gün 21-30 (P21 – P30) gelen aerodinamik ancak verim ve genel canlılığı türler ve hayvan yaş bağlı olarak değişir ama microglia sıçanlar ve fareler her yaştan itibaren yalıtmak için adapte edilebilir. Azami verimi ve biraz çocukça microglia kullanırken en iyi canlılık elde edilir (~ P9), verimleri ve yavaş yavaş biraz daha düşük seviyeleri yetişkin hayvanlarda sivrilen canlılığı ile. Microglia de fare ayrılmış olabilir ama biz fare hücreleri anlamlı olarak daha yüksek verimleri, canlılık ve ramified türleri Morfoloji, karmaşıklığı fare hücre kültürlerinde serum-Alerjik karşılaştırıldığında gösterir ki bulduk. Hayvanlar P50 daha büyük yaş bu iletişim kuralıyla değerlendirilmemiştir. Bu immunopanning yalıtım yordamı sırasında yalıtım mikroglial transkripsiyon profilleri değişiklikleri en aza indirmek için ve hücrelerin aşağı akım canlılığı en üst düzeye çıkarmak için optimize edilmiştir. Bu teknikleri ve medya formülasyonları kullanılarak, yüksek-canlılık birincil kültürler hafta boyunca sürekli olabilir. Bu koşullar altında kültürlü Microglia son derece ramified bir Morfoloji hızlı uzantısı ve geri çekme işlemleri içeren sergi ve nispeten düşük oranları yayılması. Biz serum-pozlama bu özellikler üzerinde önemini vurgulamak ve diğer yaklaşımlar göre bu yöntemin zayıf ve güçlü tartışıyorlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microglia sentinel bağışıklık hücreleri MSS gördükleri için çevresel değişiklikler oldukça tepkili olduklarını; Bu nedenle, büyük bir özenle hücrelerindeki inflamatuar yanıt onların izolasyon ve kültür8sırasında en aza indirmek için gereklidir. Bu hız ve sıcaklık bu protokolüyle içinde gerçekleştirilir. Böylece tüm Santrifüjü adımları 4 ° C’de gerçekleşmesi mümkün büyük ölçüde harekete geçirmek, azaltır zaman buz üzerinde veya 4 ° C’de hücreler…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Christopher ve Dana Reeve Vakfı Uluslararası Araştırma Konsorsiyumu Medulla Spinalis Yaralanmalarında, Dr Miriam ve Sheldon G. Adelson tıbbi araştırma Vakfı, JPB Vakfı, Novartis temel Araştırma Enstitüsü tarafından desteklenen, cömert katkıları Vincent ve Stella Coates ve Damon Runyon’un Kanser Araştırma Vakfı (DRG-2125-12).
Materials
| Rat: Sprague-Dawley | Charles River | Cat# 400 | |
| mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42) | Bio-Rad | Cat# MCA275R | Panning: 1:1,000; Staining: 1:500 |
| Goat polycolonal anti-Iba1 | Abcam | Cat# AB5076 | Staining: 1:500 |
| Rabbit polyclonal anti-Ki67 | Abcam | Cat# AB15580 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594 | Invitrogen | Cat# 11055 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-goat 488 | Invitrogen | Cat# A-21203 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647 | Invitrogen | Cat# A-31573 | Staining: 1:500 |
| Triton-X (detergent in ICC staining) | Thermo Fisher | Cat# 28313 | |
| Heparan sulfate | Galen Laboratory Supplies | Cat# GAG-HS01 | |
| Heparin | Sigma | Cat# M3149 | |
| Peptone from milk solids | Sigma | Cat# P6838 | |
| TGF-β2 | Peprotech | Cat# 100-35B | |
| Murine IL-34 | R&D Systems | Cat# 5195-ML/CF | |
| Ovine wool cholesterol | Avanti Polar Lipids | Cat# 700000P | |
| Collagen IV | Corning | Cat# 354233 | |
| Oleic acid | Cayman Chemicals | Cat# 90260 | |
| 11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid | Cayman Chemicals | Cat# 20606 | |
| Calcein AM dye | Invitrogen | Cat# C3100MP | |
| Ethidium homodimer-1 | Invitrogen | Cat# E1169 | |
| DNaseI | Worthington | Cat# DPRFS | |
| Percoll PLUS | GE Healthcare | Cat# 17-5445-02 | |
| Trypsin | Sigma | Cat# T9935 | |
| DMEM/F12 | Gibco | Cat# 21041-02 | |
| Penicillin/ Streptomycin | Gibco | Cat# 15140-122 | |
| Glutamine | Gibco | Cat# 25030-081 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma | Cat# A9165 | |
| Insulin | Sigma | Cat# 16634 | |
| Apo-transferrin | Sigma | Cat# T1147 | |
| Sodium selenite | Sigma | Cat# S-5261 | |
| DMEM (high glucose) | Gibco | Cat# 11960-044 | |
| Dapi Fluoromount-G | Southern Biotech | Cat# 0100-20 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | Cat# A-003-E | |
| Primaria Plates | VWR | Cat# 62406-456 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stock reagents | |||
| Apo-transferrin | Reconstitution: 10 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C |
||
| N-acetyl cysteine | Reconstitution: 5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C |
||
| Sodium selenite | Reconstitution: 2.5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:25,000 Storage: -20°C |
||
| Collagen IV | Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -80°C |
||
| TGF-b2 | Reconstitution: 2 mg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C |
||
| IL-34 | Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -80°C |
||
| Ovine wool cholesterol | Reconstitution: 1.5 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C |
||
| Heparan sulfate | Reconstitution: 1 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C |
||
| Oleic acid/Gondoic acid | Reconstitution: Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C |
||
| Heparin | Reconstitution: 50 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C |
||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| Perfusion Buffer | Recipe: 50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) Comments: Use when ice-cold |
||
| Douncing Buffer | Recipe: 200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ Comments: Use when ice-cold |
||
| Panning Buffer | Recipe: 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++ | ||
| Microglia Growth Medium (MGM) | Recipe: DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite Comments: Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish. |
||
| Collagen IV Coating | Recipe: MGM containing 2 μg/mL collagen IV | ||
| Myelin Seperation Buffer | Recipe: 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 Comments: Mix well after the addition of CaCl2 and MgCl2 |
||
| TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC) | Recipe: MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid Comments: Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH. |
References
- Colonna, M., Butovsky, O. Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration. Annu Rev Immunol. 35, 441-468 (2017).
- Wu, Y., Dissing-Olesen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. Microglia: Dynamic Mediators of Synapse Development and Plasticity. Trends Immunol. 36 (10), 605-613 (2015).
- Lou, N., et al. Purinergic receptor P2RY12-dependent microglial closure of the injured blood-brain barrier. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (4), 1074-1079 (2016).
- Haynes, S. E., et al. The P2Y12 receptor regulates microglial activation by extracellular nucleotides. Nat Neurosci. 9 (12), 1512-1519 (2006).
- Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), (2017).
- Lavin, Y., et al. Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment. Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).
- Hoeffel, G., Ginhoux, F. Ontogeny of Tissue-Resident Macrophages. Front Immunol. 6, 486 (2015).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).
- Bohlen, C. J., et al. Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures. Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).
- Herz, J., Filiano, A. J., Smith, A., Yogev, N., Kipnis, J. Myeloid Cells in the Central Nervous System. Immunity. 46 (6), 943-956 (2017).
