Ansträngningar för att förstå mikrogliala funktion i detalj har hindrats av bristen på mikrogliala kultur modeller som sammanfatta egenskaperna för mogna i vivo mikroglia. Det här protokollet beskriver en isolering och kultur strategi för att upprätthålla robusta överlevnad av starkt förgrenat mogen råtta mikroglia definieras-medium villkor.
Mikroglia utgör 5-10% av alla celler i centrala nervsystemet (CNS) och drar alltmer uppmärksamhet på grund av deras bidrag under utveckling, homeostas och sjukdom. Även om makrofager har studerats i detalj för årtionden, specialiserade funktioner av mikroglia, vävnad bosatta makrofager i CNS, har förblivit i stort sett mystiska, delvis på grund av begränsningar i förmågan att sammanfatta mogen mikrogliala boenden i kultur. Här visar vi ett enkelt förfarande för snabb isolering av ren mikroglia från mogna gnagare hjärnan. Vi beskriver också serumfritt odlingsbetingelser som stöder höga nivåer av mikrogliala lönsamhet över tid. Mikroglia odlade under dessa definieras-medium förhållanden uppvisar genomarbetade förgrenat processer och dynamisk övervakning beteende. Vi illustrerar vissa effekter av serumexponering på odlade mikroglia och diskutera hur dessa serumfritt kulturer jämfört med såväl serum-exponerade kulturer som mikroglia i vivo.
Som makrofager av CNS parenkymet, mikroglia interagera med ett brett spektrum av neuronala kretsar och gliaceller signalering nätverk. De spelar avgörande roller i utveckling och homeostas av hjärnan via synaptic beskärning, apoptotiska cell clearance och övergående interaktioner med neuronala processer1,2. Mikroglia är tidiga responders till neurologiska skador, utvidga deras långa, tunna processer till lesion platser att samordna inflammatoriskt svar och begränsa blödning3,4. Förändringar i mikrogliala morfologi och funktion är allestädes närvarande i både akuta och kroniska CNS-skador och mikroglia utställning förändrad morfologi, lokalisering och uttryck av inflammatoriska mediatorer i ett varierat utbud av sjukdom stater1. Människans genetiska studier visar att mutationer som förändrar risken för neurodegenerativa sjukdomar uttrycks ofta huvudsakligen eller uteslutande av mikroglia i intakt CNS, pekar till en kritisk roll för mikroglia i sjukdomspatogenes eller progression5 . Med tanke på deras framträdande i skador och sjukdom, är främja förståelsen av mikrogliala biologi en hög prioritet för att utveckla nya behandlingsmetoder.
Många viktiga framsteg för förståelsen av mikrogliala biologi har uppstått genom att extrapolera tekniker och mekanism upptäcktes i studier av andra makrofag befolkningar, inklusive kultur metoder, gen uttryck profiler och definitioner av funktionella / morfologiska stater. Även om generell makrofag funktioner spelar ofta på överraskande sätt inom CNS landskapet, mikroglia är själva mycket specialiserad, uppvisar ett förgrenat morfologi och en unik gen uttryck signatur som skiljer dem från andra vävnader makrofager6. Mikroglia har en härstamning som skiljer sig från de flesta andra vävnad makrofager; de kolonisera CNS under en tidig embryonal våg av primitiva blodbildningen och själv förnya hela livet, oberoende av bidrag från slutgiltig blodbildning7. Fullt mogen gen uttryck signaturen av adult mikroglia uppnås inte förrän den andra postnatala vecka8. Miljömässiga ledtrådar från den omgivande vävnaden spela en viktig roll i dikterar vävnadsspecifika makrofag funktioner6, vilket i CNS inkluderar begränsad exponering för blodburna faktorer som beviljats av den blood – brain barriär9.
Ett hinder för att fullt ut förstå mikrogliala bidrag till CNS homeostas och sjukdom är svårigheten att går igenom specialiserade egenskaper för mogna mikroglia sett i vivo med renat celler in vitro-. Många metoder har utvecklats för att isolera och kultur intakt mikroglia, men de flesta metoder förlitar sig på serum att stödja cellöverlevnad. Vi har visat att tillägg av serum, som är ett inneboende variabel reagens som innehåller en stor mängd bioaktiva molekyler, är särskilt problematiskt när man arbetar med mikroglia eftersom det främjar en amoeboid morfologi, ökad spridning, och ökad fagocytos9 ses ofta i vivo när mikroglia utsätts för blodburna faktorer efter störningar av den blod – hjärnbarriären. Av dessa mätvärden, serum-exponerade celler liknar mikroglia i skador eller sjukdomstillstånd, men sådana förändringar reduceras när mikroglia odlas i definierade odlingsmedium som innehåller CSF-1 (eller IL-34), TGF-β, kolesterol och selenit.
Detta protokoll ger Detaljer för odling juvenil råtta mikroglia serumfritt villkor relaterade till nyligen publicerade arbete9. Detta protokoll har effektiviserats för råttor från den 21-30 (P21 – P30), men kan anpassas till isolera mikroglia från råttor och möss i alla åldrar, även avkastning och övergripande lönsamhet varierar beroende på art och djurets ålder. Maximal avkastning och optimal lönsamhet uppnås när du använder något omogen mikroglia (~ P9), avkastning och livskraftiga gradvis avsmalnande till något lägre nivåer i vuxna djur. Mikroglia kan också isoleras från möss, men vi har funnit att råtta celler visar betydligt högre avkastningen, livskraft och komplexiteten i förgrenat morfologier, jämfört med musen celler i serumfritt kulturer. Djur år större än P50 har inte utvärderats med detta protokoll. Proceduren immunopanning isolering har optimerats att minimera förändringar i mikrogliala transkriptionell profiler under isolering och maximera nedströms livskraften hos cellerna. Använda dessa tekniker och medier formuleringar, kan hög-livskraft primära kulturer upprätthållas i veckor. Mikroglia odlade under dessa förhållanden uppvisar ett starkt förgrenat morfologi som involverar snabba förlängning och indragning av processer och låga relativt priser för spridning. Vi framhålla betydelsen av serum-exponering på dessa egenskaper och diskuterar styrkor och svagheter med denna metod i förhållande till andra metoder.
Eftersom mikroglia fungera som sentinel immunceller i CNS, är de mycket lyhörda för förändringar i miljön; Därför krävs stor omsorg för att minimera inflammatoriska reaktioner i cellerna under deras isolering och kultur8. Detta sker i detta protokoll genom fart och temperatur. Att hålla cellerna på is eller vid 4 ° C närhelst möjligt minskar aktiveringen, så alla centrifugering steg ske vid 4 ° C, djuren är perfusion med iskall perfusion buffert och protokollet har effektiviserat…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete var stöds av Christopher och Dana Reeve Foundation International Research Consortium på ryggmärgsskada, Dr Miriam och Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation, JPB Foundation, Novartis Institutet för grundläggande forskning, generösa bidrag från Vincent och Stella Coates, och Damon Runyon Cancer Research Foundation (DRG-2125-12).
Rat: Sprague-Dawley | Charles River | Cat# 400 | |
mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42) | Bio-Rad | Cat# MCA275R | Panning: 1:1,000; Staining: 1:500 |
Goat polycolonal anti-Iba1 | Abcam | Cat# AB5076 | Staining: 1:500 |
Rabbit polyclonal anti-Ki67 | Abcam | Cat# AB15580 | Staining: 1:500 |
Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594 | Invitrogen | Cat# 11055 | Staining: 1:500 |
Alexa Fluor Donkey anti-goat 488 | Invitrogen | Cat# A-21203 | Staining: 1:500 |
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647 | Invitrogen | Cat# A-31573 | Staining: 1:500 |
Triton-X (detergent in ICC staining) | Thermo Fisher | Cat# 28313 | |
Heparan sulfate | Galen Laboratory Supplies | Cat# GAG-HS01 | |
Heparin | Sigma | Cat# M3149 | |
Peptone from milk solids | Sigma | Cat# P6838 | |
TGF-β2 | Peprotech | Cat# 100-35B | |
Murine IL-34 | R&D Systems | Cat# 5195-ML/CF | |
Ovine wool cholesterol | Avanti Polar Lipids | Cat# 700000P | |
Collagen IV | Corning | Cat# 354233 | |
Oleic acid | Cayman Chemicals | Cat# 90260 | |
11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid | Cayman Chemicals | Cat# 20606 | |
Calcein AM dye | Invitrogen | Cat# C3100MP | |
Ethidium homodimer-1 | Invitrogen | Cat# E1169 | |
DNaseI | Worthington | Cat# DPRFS | |
Percoll PLUS | GE Healthcare | Cat# 17-5445-02 | |
Trypsin | Sigma | Cat# T9935 | |
DMEM/F12 | Gibco | Cat# 21041-02 | |
Penicillin/ Streptomycin | Gibco | Cat# 15140-122 | |
Glutamine | Gibco | Cat# 25030-081 | |
N-acetyl cysteine | Sigma | Cat# A9165 | |
Insulin | Sigma | Cat# 16634 | |
Apo-transferrin | Sigma | Cat# T1147 | |
Sodium selenite | Sigma | Cat# S-5261 | |
DMEM (high glucose) | Gibco | Cat# 11960-044 | |
Dapi Fluoromount-G | Southern Biotech | Cat# 0100-20 | |
Poly-D-Lysine | Sigma | Cat# A-003-E | |
Primaria Plates | VWR | Cat# 62406-456 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Stock reagents | |||
Apo-transferrin | Reconstitution: 10 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C |
||
N-acetyl cysteine | Reconstitution: 5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C |
||
Sodium selenite | Reconstitution: 2.5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:25,000 Storage: -20°C |
||
Collagen IV | Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -80°C |
||
TGF-b2 | Reconstitution: 2 mg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C |
||
IL-34 | Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -80°C |
||
Ovine wool cholesterol | Reconstitution: 1.5 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C |
||
Heparan sulfate | Reconstitution: 1 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C |
||
Oleic acid/Gondoic acid | Reconstitution: Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C |
||
Heparin | Reconstitution: 50 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C |
||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solutions | |||
Perfusion Buffer | Recipe: 50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) Comments: Use when ice-cold |
||
Douncing Buffer | Recipe: 200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ Comments: Use when ice-cold |
||
Panning Buffer | Recipe: 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++ | ||
Microglia Growth Medium (MGM) | Recipe: DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite Comments: Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish. |
||
Collagen IV Coating | Recipe: MGM containing 2 μg/mL collagen IV | ||
Myelin Seperation Buffer | Recipe: 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 Comments: Mix well after the addition of CaCl2 and MgCl2 |
||
TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC) | Recipe: MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid Comments: Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH. |