Протокол, описанные здесь, это метод для измерения endoreduplication внутри клубней картофеля (Solanum tuberosum). Она включает в себя плазмолиза и протопластов извлечения шаги для уменьшения шума и мусора в анализ гранулярных вниз по течению потока.
Endoreduplication, репликация ядерного генома клетки без последующего цитокинез, дает клетки с повышенным содержанием ДНК и ассоциируется с специализации, развития и роста в клеточных размер. В растениях endoreduplication, как представляется, содействия росту и расширению некоторых тканей и органов. Среди них – клубней картофеля (Solanum tuberosum), который претерпевает значительные сотовой расширения в выполнении его функции хранения углеводов. Таким образом endoreduplication может играть важную роль в как клубни способны вместить это обилие углерода. Однако сотовой мусора, вытекающие из сырой изоляции ядерных методов клубней, методы, которые могут быть использованы эффективно с листьями, исключает оценки индекса endoreduplication клубней (EI). Эта статья представляет технику для оценки endoreduplication клубней через изоляции протопласта, в то время как демонстрации представитель результаты получены из различных генотипов и разобщенным тканей клубня. Основные ограничения протокола являются расходы на время и реагентов, необходимых для подготовки проб, а также относительно короткий срок образцов после лизиса протопласта. В то время как протокол чувствителен к технических вариантов, он представляет улучшение над традиционными методами ядерной изоляции от этих крупных специализированных клеток. Предлагаются возможности для усовершенствования протокола например рециркуляции фермента, использование фиксативов и другие изменения.
Endoreduplication — это процесс, в которой клетки forgoes типичный клеточного цикла и вместо этого подвергается альтернативный курс развития, состоящий из повторяющихся раундов репликации ДНК без клеточное деление. Результирующая ячейка будет увеличена ДНК контента и ядерный размер, который считается играть определенную роль в клеточной регуляции, расширение и специализации. Как правило раунд endoreduplication (называется endocycle) и соответствующее увеличение содержание ДНК, связанные с большего объема клетки, наблюдение, что вызвало «karyoplasmic теория», что повышенное содержание ДНК требуется правильно регулировать больше, возможно, более комплекс, ячейка1. Это явление встречается в высших растений, в широкий спектр тканей, в том числе с структурных/оборонительного (трихом)2,3, было отмечено питательные (кукуруза эндосперм)4,5и раковина/хранения ( Томат околоплодника; 8 функции клубней картофеля)6,,7,. В плодах было предложено, что endoreduplication играет определенную роль в содействии быстрое расширение околоплодника, что подтверждается негативного отношения между endoreduplication и плоды развития период9. К примеру клетки с ДНК контента до 512C (512 раз гаплоидным геномом) наблюдались в томатном околоплодник8. Кроме того Шевалье et al. (2014) показал, что изменения в экспрессии генов клеточного цикла может привести к повышение уровня endoreduplication в пределах околоплодника который затем приводит к более крупные плоды10. Таким образом изменения генов, содействие endoreduplication обеспечивает потенциальной мишенью для улучшения биомассы или урожайности путем селекции растений или генетические манипуляции. Однако такое улучшение зависит от более глубокого понимания причин и последствий endoreduplication.
Endoreduplication наиболее часто измеряется через проточной цитометрии, whereby ядер, выпущенный в сырой ткани препаратов11, инкубируют с ДНК связывающих Флюорофор, такие как пропидий йодидом12 (PI). Отфильтрованных выборок затем передаются лазером проточный цитометр, где можно наблюдать выбросов длин волн для Флюорофор. Интенсивность флуоресценции в каждом событии (то есть ядро) напрямую коррелирует с ДНК содержание частиц. Таким образом сравнивая с известным стандарта, может рассчитываться относительное и абсолютное содержание ДНК клеток в данной выборке. Endoreduplication индексы (EI) определяются путем создания среднее количество endocycles в клетку в образец, наблюдая за содержание клеточной ДНК (C-значение) где 1C является содержание ДНК клеток haploid (Формула представлены в шаге 6.7 протокол). К примеру в диплоидный организм, базовый содержание ДНК соматических клеток — 2C. Если образец имеет несколько клеток с 4C, соответствующий для одного раунда endoreduplication, или больше было бы EI около 0; Однако если почти все клетки являются 4C EI бы приблизительно 1. Однако как несколько раундов endoreduplication являются общими в высших растений наблюдается EI значения могут быть намного больше. При расчете endoreduplication индексов может быть сравнительно простой, он требует, что относительного обилия ядер C-значения будут надежно выяснена, исключающей в определенных видов и тканей (в том числе клубней картофеля). Вполне вероятно, что различия в клеточном анатомии, химии или клеточной стенки композиция13 вызывают эти примеры, чтобы быть упорствующих в типичных подготовку с помощью лезвия бритвы выпустить ядер непосредственно в соответствующие буферы, которые обычно используются с тканей, таких как томат околоплодника модель для endoreduplication исследований8.
В картофель изучение endoreduplication в пределах клубня по-прежнему ограничивается только пару исследования, возможно, отчасти объясняется отсутствием надежного протокола как вышеупомянутые сырой препараты дают противоречивые результаты. Хотя такие подходы хорошо работать для листьев, образцы клубней опыт серьезной деградации и обилие шума в виде мусора, делая дифференциации пиков, состоящая из ядер значениями различных C-почти невозможно. Это возможно из-за различий в клеточный состав и обилием сотовой мусора внутри клетки клубня (например. хранение крахмала Амилопласты). Чтобы преодолеть это препятствие, мы недавно разработали более надежный протокол для приобретения различимых пиков в проточной цитометрии клубней картофеля. Частота ячейки в пределах каждой пик затем может использоваться для расчета точной endoreduplication уровни для разных генотипов или различных тканей, которые составляют клубней. Протокол, который использует изменение протопластов извлечения метода14,15 предшествующая описано ранее потока цитометрии11, показали значительные различия в пределах картофеля родственников, сортов и тканях16 . Здесь мы представляем протокол в деталях, оценивая EI в контекстах плоидности, ткани и Размер клубня.
Протокол, представленные в настоящем документе обеспечивает исследователей с средства для оценки endoreduplication в клубнях картофеля, чьи модифицированных сотовых контента и увеличение размер ячейки казалось бы исключать другие препараты цитометрии потока. Протокол опирается на протопластов поколения как средство для снижения шума и мусора при сохранении ядерного целостности. Ранее исследователи описанные аналогичные препараты для особо упорствующих потока цитометрии образцов, а также использованы клубней протопласта изучать различные темы, такие как патогенеза19,20. Однако к нашему знанию, ни объединили использование таких протопласта клубней с проточной цитометрии с целью изучения endoreduplication. Кроме того мы нашли применение протопласта более надежными, чем типичный сырой препаратов, а также техника используется в двух только другие исследования для оценки клубней endoreduplication6,7. Здесь мы обсуждаем недостатки протокола, потенциальные проблемы в ее подготовке исполнения и образца и результаты типичный эксперимента, который использует его.
Несмотря на полезность и повторяемость протоколом cytometry потока клубней он имеет несколько недостатков, которые следует обсудить. Чтобы начать, протокол является время интенсивных, требуя две ночи инкубаций. Кроме того протокол требует некоторых дорогостоящих реагентов, особенно целлюлазы и macerozyme. Кроме того ведется подготовка время высокочувствительных, унижающего достоинство в течение нескольких часов, которые могут ограничить пропускную способность в течение одного дня, особенно если много событий. И наконец протокол, в то время, как надежный, чувствителен к ошибок в пробоподготовки, все из которых, как представляется, привести к повреждению ядер и Нижняя качественных результатов. К примеру микробной контаминации может произойти во время плазмолиза и протопластов поколения шаги (1 – 3.4) из-за неправильного асептической техники. Пример загрязнения, хотя не всегда исключает успех образца, как представляется, резко снизить качество полученных гистограмм, снова скорее всего из-за повреждения ядра.
Как отмечалось ранее основных недостатков протокола являются расходы, время и чувствительность к ошибкам. Исследователи, возможно, пожелает принять меры для смягчения каждого из них. Что касается стоимости исследователи, намеревающиеся применять протокол для многих образцов может рассмотреть вопрос об изменении концентрации фермента и/или продолжительности переваривания шаг как различных тканей и генотипов могут варьироваться в реагировании. Это включает в себя возможность фильтрации и рециркуляции ES, которая ранее была продемонстрирована но не работающих здесь21. Что касается времени, в наши наблюдения можно обойтись с первой инкубации (плазмолиза шаг) и по-прежнему извлекать протопласта; Однако будут страдать их целостности и изобилия, который негативно влияет на результаты. Для уменьшения износа образцов исследователи могут считают, что некоторые потока цитометрии подходы включают использование фиксативов (например, формальдегид) для сохранения целостности образец22. Это может быть полезным средством предотвращения ухудшения и разрешить для выборки хранения, вместо того, чтобы протопластов взыскание и потока цитометрии происходящих в тот же день, как представил. Еще одним средством предотвращения истощения ядер может быть включить ингибитор нуклеиназы ES и/или СКС; в то время как 2-меркаптоэтанол осуществлено без заметных изменений в процессе разработки, другие ингибиторы не были протестированы здесь.
В нашем наблюдении единственным наиболее важным шагом является шагом 4.4, удаление всех плазмолиза промывочный раствор перед добавлением цитометрии буфера потока (FCB). Если даже небольшой объем (< 10 мкл) остается, образцы имеют гораздо больше шансов к деградации, которая может привести к бедным или даже сбой образца. Это, вероятно, из-за примесей в рамках решения фермента (например nucleases, протеаз)23,24 , которая быстро деградируют ядра во время инкубационного периода и время между запусками образца, даже при низких концентрациях. Еще одним важным фактором является продолжительность PI и РНКазы шагов инкубации. Как отмечено в протоколе, образцы не остаются стабильными более чем на несколько часов после добавления FCB исследователи могут решили сократить продолжительность эти шаги, чтобы вместить больше образцов или длительных проточной цитометрии результате низкой ядер концентрации. Это также требует исследователя рассмотреть компромисс между число событий каждого образца и общее количество выборок, запускать или рассмотреть использование фиксативов как упоминалось ранее.
Различия между тканей и генотипов
Чтобы обеспечить результаты представитель протокола мы разработали два простых экспериментов для подтверждения сообщалось ранее вариации, ткани и изучить влияние плоидности и генотип. Результаты эксперимента ткани продемонстрировать, что протокол дает воспроизводимые результаты, как сердцевина ткани было вновь установлено высоким EI. Несколько удивительно паренхимы ткани, которая ранее не была проведена, имел значение EI аналогичны кортикального слоя ткани и значительно ниже, чем сердцевина. Это был непредвиденные, как клетки паренхимы, обычно больше, чем сердцевина или корковых клеток, по крайней мере в конце срока. Одно из возможных объяснений заключается, что клубни (90-130 g) были слишком незрелыми для паренхиме клеток, которые составляют большинство объема клубней на зрелость, чтобы полностью расширились и достигло своей максимальной C-значения25. Это может также объяснить, почему dihaploid (VT_SUP_19) и два раза dihaploid (VT_SUP_19 4 x) продемонстрировала значительно более EI чем cv. Улучшенный клубней; в то время как клубни примерно одинакового размера были взяты пробы от каждого генотипа, максимальный размер клубней от VT_SUP_19 или isogenic тетраплоидный гораздо меньше, чем прародителя. Таким образом, может быть, что они отображаются более EI просто потому, что они были больше относительно их максимальный достижимый размер. Кроме того разница может быть следствием генетических комплемента, VT_SUP_19 получил от его тетраплоидные прародителя. Другая возможность заключается, что геномной сокращения, которое произошло по добыче dihaploid от тетраплоидные может разоблачили пагубные аллели привело завод-стресс, который также был показан вносить повышенных EI26. Тем не менее это демонстрирует, что тщательного изучения исследователи должны использовать при выборе клубни и тканей использоваться для сравнения значения EI, особенно между генотипов.
Будущие приложения
Протокол, описанные в этой статье обеспечивает исследователей с важным инструментом для понимания endoreduplication картофеля. Это может позволить для исследований в генетических и экологических компонентов endoreduplication, время курс развития через тканей клубня и оценки естественной изменчивости. В конечном счете endoreduplication может сделать перспективных мишенью для улучшения картофеля, обязательство, которое потребует надежным средством оценки.
The authors have nothing to disclose.
Это исследование финансировалось национальной науки фонд премии номер 1237969, «Распутывая гетерозиготности, аллельные состав и скопировать номер вариации картофеля» и USDA Специальный грант 2014-34141-22266 (Университет штата Мэн) для RV.
Serological pipette | Fisher | 13-676-10k | (sterile) |
Pipet Aid XP (autopipettor) | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
Conical tubes (50 ml) | Thermo Fisher Scientific | 339652 | (sterile) |
Microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Globe Scientific | 111558 | |
Microcentrifuge tubes (2 ml) | Globe Scientific | 111552 | |
Vacuum filtration unit (0.22µm)(aPES) | Thermo Fisher Scientific | 564-0020 | (sterile) |
Vacuum filtration unit (0.45µm)(aPES) | Thermo Fisher Scientific | 168-0045 | (sterile) |
Cellulase "Onozuka R-10" | Yakult | contact company | |
Macerozyme "Onozuka R-10" | Yakult | contact company | |
Hemicellulase | Sigma | H2125 | |
Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
MES buffer | Acros Organics | 172590250 | |
Triton X-100 | MP Biochemicals | 194854 | |
Magnesium Chloride (hexahydrate) | Fisher Scientific | M35-500 | |
Calcium Chloride (dihydrate) | Fisher Scientific | C79-500 | |
D-Mannitol | Acros Organics | 423922500 | |
MOPS | Acros Organics | 17263-0250 | |
Potassium Phosphate (monobasic, anhydrous) | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | For flow cytometry preparations |
Ribonuclease A | Sigma-Aldrich | R5000 | For flow cytometry preparations |
Cork borers with punch | American Scientific | 2093-02 | For smapling desired tissue |
Forceps | Thermo Fisher Scientific | 16-31 | For smapling desired tissue |
Scalpel | Thermo Fisher Scientific | 08-920B | For smapling desired tissue |
106um stainless steel mesh or other seive of same pore size | New Jersey Wire Mesh Co. | contact company |