التنميط الحمض النووي توقيت النسخ المتماثل باستخدام الزرد كنظام نموذجي في فيفو
Summary
واستخدمت مؤخرا الزرد كنظام نموذجي في فيفو لدراسة توقيت تكرار الحمض النووي أثناء التطوير. وإليك تفاصيل البروتوكولات لاستخدام الأجنة الزرد إلى توقيت النسخ المتماثل الشخصية. هذا البروتوكول يمكن تكييفها بسهولة لدراسة توقيت النسخ المتماثل في طفرات وأنواع الخلايا الفردية ونماذج الأمراض والأنواع الأخرى.
Abstract
توقيت تكرار الحمض النووي سمة هامة خلوية، نستعرض علاقات هامة مع هيكل الكروماتين، والنسخ، ومعدلات الطفرة في الحمض النووي. تحدث التغييرات في توقيت النسخ المتماثل أثناء التطوير والسرطان، ولكن توقيت النسخ المتماثل دور يؤديه في التنمية والمرض غير معروف. الزرد أنشئت مؤخرا كنظام نموذجي في فيفو لدراسة توقيت النسخ المتماثل. وإليك تفاصيل البروتوكولات لاستخدام في الزرد لتحديد توقيت تكرار الحمض النووي. وبعد فرز الخلايا من الأجنة والبالغين الزرد، يمكن بناؤها على نطاق الجينوم الحمض النووي النسخ المتماثل توقيتها النقوش ذات الدقة العالية بتحديد التغيرات في عدد نسخ الحمض النووي من خلال تحليل البيانات تسلسل الجيل القادم. يتيح هذا النظام النموذجي الزرد لتقييم توقيت النسخ المتماثل للتغييرات التي تحدث في المجراة في التنمية، ويمكن أيضا استخدامها لتقييم التغيرات في أنواع الخلايا الفردية أو نماذج المرض أو خطوط المسخ. هذه الأساليب سيمكن دراسات التحقيق في آليات ومحددات للنسخ المتماثل لتوقيت إنشاء وصيانة خلال التنمية، وتوقيت النسخ المتماثل لدور تلعبه في الطفرات وتوموريجينيسيس، وآثار مقاومة توقيت النسخ المتماثل في التنمية والمرض.
Introduction
للخلايا لتقسيم بنجاح، يجب أن أولاً بدقة وإخلاص النسخ المتماثل الجينوم أكمله. حدوث ازدواج الجينوم في نمط استنساخه، المعروفة باسم ال DNA النسخ المتماثل توقيت البرنامج1. ويرتبط توقيت تكرار الحمض النووي مع منظمة الكروماتين وعلامات جينية والتعبير الجيني2،3. التغييرات في توقيت النسخ المتماثل تحدث في جميع أنحاء التنمية، والبرامج ذات الصلة إلى حد كبير إلى النسخي والتعديلات لعلامات الكروماتين وتنظيم4،5. وعلاوة على ذلك، يرتبط توقيت النسخ المتماثل مع الترددات حيث، وهي تلاحظ تغييرات في توقيت في أنواع مختلفة من السرطان6،،من78. وعلى الرغم من هذه الملاحظات، الآليات والمحددات للنسخ المتماثل لتوقيت إنشاء وتنظيم لا تزال غير معروفة إلى حد كبير، والدور الذي تؤديه في التنمية ومرض غير محدد. وباﻹضافة إلى ذلك، حتى مؤخرا في النسخ المتماثل على نطاق الجينوم توقيت التغييرات التي تحدث في جميع أنحاء تطوير الفقارية فقط بحثت في نماذج الثقافة الخلية.
الزرد، دانيو rerio، مناسبة تماما لدراسة النسخ المتماثل توقيتها في فيفو أثناء التطوير، كما يمكن أن تسفر عن زوج التزاوج واحد من مئات أجنة التي تتطور سريعاً مع العديد من أوجه التشابه إلى التنمية الثدييات9، 10. وعلاوة على ذلك، في جميع أنحاء تطوير الزرد، هناك تغييرات في دورة الخلية، تنظيم الكروماتين والنسخي البرامج التي تشترك في علاقات مع الحمض النووي النسخ المتماثل توقيتها11. الزرد أيضا نموذج وراثية ممتازة، كما هم خاصة قابلة للتلاعب من قبل ترانسجينيسيس، والطفرات والتحولات المستهدفة، والشاشات الوراثية حددت العديد من الجينات المطلوبة لتطوير الفقارية12. ولذلك، يمكن استخدام الزرد لتحديد الجينات المشاركة في النسخ المتماثل توقيت إنشاء وصيانة ومراقبة آثار رفع الضوابط عن توقيت النسخ المتماثل في التنمية الفقاريات. يمكن أيضا استخدام خطوط محوره وراثيا لتقييم توقيت النسخ المتماثل من أنواع الخلايا الفردية المعزولة في تيميبوينتس التنموية المختلفة، أو في ظروف المرض. الأهم من ذلك، هناك نماذج مختلفة من الزرد من الأمراض البشرية التي يمكن استخدامها للتحقيق في دور النسخ المتماثل توقيتها في المرض تشكيل وتطور9،،من1314.
في الآونة الأخيرة، تم إنشاؤها الملامح توقيت النسخ المتماثل الأولى من الزرد، تجعله كنظام نموذجي لدراسة النسخ المتماثل توقيتها في فيفو15. لتحقيق هذا الهدف، تم جمع الخلايا من الأجنة الزرد في مراحل متعددة من التنمية، وفي نوع خلية عزلها من الزرد الكبار. ثم تم فرز الخلايا بنظام مراقبة الأصول الميدانية (الأسفار تنشيط الخلية الفرز) استناداً إلى محتوى الحمض النووي لعزل السكان المرحلة G1 و S. استخدام نموذج G1 كعنصر تحكم عدد نسخ، نسخ عدد الاختلافات في مرحلة ثانية السكان كانت مصممة وتستخدم للاستدلال على النسخ المتماثل النسبي توقيت16. التغييرات في توقيت النسخ المتماثل يمكن مقارنتها مباشرة ثم بين نماذج إنمائية مختلفة وأنواع الخلايا، وكان يستخدم هذا لتحديد التغيرات في توقيت النسخ المتماثل التي تحدث في فيفو طوال إعداد الفقاريات. هذا الأسلوب يوفر العديد من المزايا الأخرى الأساليب الجينومية، أساسا أنه يتطلب وضع العلامات مع النظير thymidine أو إيمونوبريسيبيتيشن للحمض النووي4،6.
هنا مفصلة على الشخصية على نطاق الجينوم الحمض النووي النسخ المتماثل توقيتها في البروتوكولات عالية الدقة في الزرد. استخدمت هذه البروتوكولات لتحديد العلاقات مع ميزات الجينوم وجينيه في الجينوم الزرد، فضلا عن تحديد ملامح التغييرات في هذه العلاقات التي تحدث في جميع أنحاء التنمية. هي أيضا بسهولة تكييف هذه البروتوكولات لدراسة التغيرات في توقيت النسخ المتماثل في سلالات متحولة من الزرد ونماذج المرض. بالإضافة إلى ذلك، توفر هذه الأساليب أساسا التي يمكن توسيعها عند دراسة توقيت النسخ المتماثل في أنواع محددة من الخلايا، بفرز أول أنواع خلايا فردية من الزرد. يمكن أن تكون الزرد ممتازة في فيفو نموذج نظام لدراسة توقيت النسخ المتماثل وتكشف الوظائف البيولوجية لهذا سمة جينية هامة في نهاية المطاف.
Protocol
Representative Results
Discussion
الزرد توفير نظام نموذجية جديدة وفريدة من نوعها في فيفو لدراسة توقيت تكرار الحمض النووي. عندما يتم تنفيذ ماتينجس موقوت مفصلة في هذا البروتوكول التجريبي، يمكن جمع آلاف أجنة في يوم واحد للتجارب. هذه الأجنة تطوير شكل متزامن من خلال دقة توقيت ووضوح تتسم مراحل التنمية. يمكن تقسيم الزرد بسه?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان يدعمها المعهد الوطني للعامة الطبية العلوم “المعاهد الوطنية للصحة” عن طريق المنح 5P20GM103636-02 (بما في ذلك الدعم الأساسي التدفق الخلوي) و 1R01GM121703، فضلا عن جوائز من مركز أوكلاهوما “الخلايا الجذعية من البالغين” البحث.
Materials
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C79-500 | |
| MgSO4 | EMD Millipore | MMX00701 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | protease solution |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D1408 | |
| Ethanol (EtOH) | KOPTEC | V1016 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9647-100G | |
| Propidium Iodide (PI) | Invitrogen | P3566 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| EDTA | Sigma | E9844 | |
| SDS | Santa Cruz | sc-24950 | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Phenol:Chloroform | Sigma | P3803-100ML | |
| Sodium acetate | J.T.Baker | 3470 | |
| Glycogen | Ambion | AM9510 | |
| RNase A | Thermo Scientific | EN0531 | |
| Quanit-iT | Invitrogen | Q33130 | Reagents for fluorescence-based DNA quantification |
| Covaris AFA microTUBE | Covaris | 520045 | specialized tube for sonication |
| Covaris E220 Sonicator | Covaris | E220 | focused ultrasonicator |
| Agilent 4200 Tapestation | Agilent | G2991AA | automated electrophoresis machine |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | Reagents for automated electrophoresis machine |
| NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | Cat#E7370L | DNA library preparation kit |
| NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 1) | NEB | Cat#E7335S | multiplex oligos for DNA library preparation kit |
| NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 2) | NEB | Cat#E7500S | additional multiplex oligos for DNA library preparation kit |
| NEBNext Library Quant Kit for Illumina | NEB | E7630L | quantification kit for library preparation |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63882 | magnetic beads |
| Illumina HiSeq 2500 | Illumina | SY–401–2501 | next generation DNA sequencing platform |
| 40 µm Falcon Nylon Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| VWR Disposable Petri Dish 100 x 25 mm | VWR | 89107-632 | |
| 6.0 mL Syringe for Nichiryo Model 8100 | VWR | 89078-446 | |
| Posi-Click Tubes, 1.7 mL, Natural Color | Denville Scientific | C2170 (1001002) | Dnase/Rnase free |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Wash Bottles | VWR | 16650-022 | Low-Density Polyethylene, Wide Mouth |
| Strainer | VWR | 470092-440 | 6.9 cm, fine mesh |
| Corssing tank | Aquaneering | ZHCT100 | individual breeding tank |
| iSpawn | Techniplast | N/A | large breeding tank |
| FACSAria II | BD biosciences | N/A | cell sorting machine |
| Wild M5a steromicroscope | Wild Heerbrugg | N/A | dissecting microscope |
| Qubit 3 Fluorometer | Thermo Scientific | Q33216 | quantitative fluorescence-based method for determining DNA concentration |
| Matlab | Mathworks | version 2017a | |
| Matlab Statistics Toolbox | Mathworks | version 11.1 | |
| Matlab Curve Fitting Toolbox | Mathworks | version 3.5.5 |
References
- Rhind, N., Gilbert, D. M. DNA replication timing. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (8), a010132 (2013).
- Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
- Rivera-Mulia, J. C., et al. Dynamic changes in replication timing and gene expression during lineage specification of human pluripotent stem cells. Genome Res. 25 (8), 1091-1103 (2015).
- Hiratani, I., et al. Global reorganization of replication domains during embryonic stem cell differentiation. PLoS Biol. 6 (10), e245 (2008).
- Hiratani, I., et al. Genome-wide dynamics of replication timing revealed by in vitro models of mouse embryogenesis. Genome Res. 20 (2), 155-169 (2010).
- Koren, A., et al. Differential relationship of DNA replication timing to different forms of human mutation and variation. Am J Hum Genet. 91 (6), 1033-1040 (2012).
- Ryba, T., et al. Abnormal developmental control of replication-timing domains in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Genome Res. 22 (10), 1833-1844 (2012).
- Sima, J., Gilbert, D. M. Complex correlations: replication timing and mutational landscapes during cancer and genome evolution. Curr Opin Genet Dev. 25, 93-100 (2014).
- Veldman, M. B., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatr Res. 64 (5), 470-476 (2008).
- Link, B. A., Megason, S. G. Zebrafish as a Model for Development. Sourcebook of Models for Biomedical Research. , 103-112 (2008).
- Siefert, J. C., Clowdus, E. A., Sansam, C. L. Cell cycle control in the early embryonic development of aquatic animal species. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 178, 8-15 (2015).
- Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicol Sci. 86 (1), 6-19 (2005).
- Dooley, K., Zon, L. I. Zebrafish: a model system for the study of human disease. Curr Opin Genet Dev. 10 (3), 252-256 (2000).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122 (7), 2337-2343 (2012).
- Siefert, J. C., Georgescu, C., Wren, J. D., Koren, A., Sansam, C. L. DNA replication timing during development anticipates transcriptional programs and parallels enhancer activation. Genome Res. 27 (8), 1406-1416 (2017).
- Koren, A., et al. Genetic variation in human DNA replication timing. Cell. 159 (5), 1015-1026 (2014).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
