פרופיל תזמון שכפול ה-DNA באמצעות דג זברה כמערכת מודל In Vivo
Summary
דג זברה שימשו לאחרונה מערכת מודל ויוו ללמוד תזמון שכפול ה-DNA במהלך הפיתוח. . זה מפורט הפרוטוקולים עבור שימוש דג זברה העוברים של פרופיל שכפול תזמון. פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות ללמוד שכפול תזמון מוטציות, סוגי תאים בודדים, מודלים המחלה ו מינים אחרים.
Abstract
תזמון שכפול ה-DNA הוא מאפיין חשוב הסלולר, מפגין יחסים משמעותיים עם הכרומטין, שעתוק DNA מוטציה המחירים. מתרחשים שינויים בתזמון שכפול במהלך התפתחות של סרטן, אבל העיתוי שכפול תפקיד ממלא בהתפתחות, המחלה לא ידוע. דג זברה הוקמו לאחרונה מערכת מודל ויוו ללמוד שכפול תזמון. . זה מפורט הפרוטוקולים עבור שימוש של דג זברה כדי לקבוע תזמון שכפול ה-DNA. לאחר מיון תאי העוברים, דג זברה למבוגרים, ניתן לבנות דפוסי תזמון שכפול DNA הגנום כולו ברזולוציה גבוהה על-ידי קביעת שינויים מספר עותק DNA בעזרת ניתוח של נתונים רצף ‘ הדור הבא ‘. דג זברה מודל המערכת מאפשרת הערכה של השינויים תזמון שכפול להתרחש ויוו במהלך ההתפתחות, והוא יכול לשמש גם כדי להעריך שינויים סוגי תאים בודדים, מודלים המחלה או הקווים המוטנטים. שיטות אלה יאפשרו מחקרים חוקרת את מנגנוני ואת גורמים של שכפול עיתוי הקמה, אחזקה במהלך הפיתוח, העיתוי שכפול תפקיד ממלא מוטציות tumorigenesis, ואת ההשפעות של perturbing תזמון שכפול על פיתוח ומחלות.
Introduction
עבור תאים לחלק בהצלחה, הם חייבים קודם בדייקנות ובנאמנות לשכפל את הגנום כולו שלהם. שכפול גנום מופיעה תבנית לשחזור, המכונה תוכנית1תזמון שכפול ה-DNA. תזמון שכפול ה-DNA הוא מתואם עם כרומטין הארגון, סימני epigenetic ג’ין ביטוי2,3. שינויים בתזמון שכפול להתרחש במהלך הפיתוח, ויש תוכניות באופן משמעותי הקשורים תעתיק והשינויים סימני כרומטין, ארגון4,5. יתר על כן, שכפול התזמון הוא מתואם עם תדרים mutational, שינויים בתזמון שנצפו בסוגים שונים של סרטן-6,–7,–8. למרות ההבחנות הללו, מנגנונים של גורמים של שכפול עיתוי הקמה ורגולציה ידועות עדיין במידה רבה, התפקיד אותו ממלא בהתפתחות ואת המחלה הוא לא נקבע. בנוסף, עד לאחרונה שכפול הגנום כולו עיתוי השינויים המתרחשים במהלך פיתוח חוליות רק נבדקו במודלים התרבות תאים.
דג זברה, רזבורה rerio, מתאימים היטב לימודים שכפול תזמון ויוו במהלך הפיתוח, כמו זוג ההזדווגות יחיד ניתן תשואות של מאות העוברים המתפתחים במהירות עם קווי דמיון רבים יונקים פיתוח9, 10. יתר על כן, במהלך פיתוח דג זברה, ישנם שינויים מחזור התא, כרומטין הארגון ותוכניות תעתיק החולקות קשרים עם תזמון שכפול הדנ א11. דג זברה הם גם מודל גנטי מעולה, כפי שהם נתונות במיוחד למניפולציות של transgenesis, מוטגנזה מכוונת, מוטציות יישוב, מסכי גנטי זיהו גנים רבים הדרושים עבור פיתוח חוליות12. לכן, דג זברה יכול לשמש לזיהוי גנים המעורבים שכפול עיתוי הקמה, אחזקה, כדי לבחון את ההשפעות של deregulating שכפול תזמון על פיתוח חוליות. קווים הטרנסגניים יכול לשמש גם כדי להעריך את תזמון שכפול של סוגי תאים בודדים מבודדת timepoints התפתחותיים שונים או בתנאים המחלה. חשוב, ישנם מודלים שונים דג זברה של מחלות אנושיות יכול לשמש כדי לחקור את התפקיד של שכפול תזמון המחלה היווצרות והתקדמות9,13,14.
לאחרונה, הפרופילים תזמון שכפול הראשון היו להפיק של דג זברה, ביסוס זה כמערכת מודל ללמוד שכפול עיתוי ויוו15. כדי לעשות זאת, תאים נאספו מעוברים דג זברה-בשלבים רבים של פיתוח, בסוג תא מבודד דג זברה למבוגרים. התאים היו אז לפי FACS (תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון) בהתבסס על תוכן ה-DNA כדי לבודד אוכלוסיות שלב G1 ו- S. באמצעות המדגם G1 כפקד מספר עותק, העתק מספר וריאציות בשלב S אוכלוסיות היו נחושים ומשמש להסיק שכפול היחסי תזמון16. שינויים בתזמון שכפול ניתן לאחר מכן ישירות להשוות בין סוגי תאים ודוגמאות התפתחותיים שונים, זה שימש לקביעת שינויים בתזמון שכפול המתרחשים ויוו במהלך פיתוח חוליות. שיטה זו מציעה כמה יתרונות על פני שיטות אחרות גנומית, בעיקר כי זה לא דורש תיוג עם תחליפי תימידין או immunoprecipitation של ה-DNA4,6.
. זה מפורט הפרוטוקולים של הגנום כולו פרופיל DNA שכפול תזמון-ברזולוציה גבוהה בדג זברה. פרוטוקולים אלה שימשו לקביעת יחסים עם תכונות גנומית של epigenetic הגנום דג זברה, כמו גם יצירת פרופיל שינויים ביחסים אלו שמתרחשות במהלך הפיתוח. פרוטוקולים אלה בקלות גם מותאמים ללמוד שינויים בתזמון שכפול זנים מוטציה של דג זברה, במודלים של המחלה. בנוסף, שיטות אלה מספקים בסיס ניתן להרחיב על ללמוד שכפול תזמון סוגי תאים ספציפיים, על-ידי מיון הראשון החוצה את סוגי תאים בודדים מ דג זברה. דג זברה יכול לשמש כמערכת מעולה ויוו דגם ללמוד שכפול תזמון וכדי לחשוף בסופו של דבר בפונקציות ביולוגיות של תכונה epigenetic חשובה זו.
Protocol
Representative Results
Discussion
דג זברה לספק מערכת מודל חדש וייחודי ויוו ללמוד תזמון שכפול ה-DNA. מתי matings מתוזמן מבוצעות כפי המפורט בעלון זה נסיוני, אלפי עוברי ניתן לאסוף ביום אחד לניסויים. אלה העוברים לפתח באופן סינכרוני באמצעות בדיוק בעיתוי ומתאפיינות במובהק שלבי הפיתוח. דג זברה יכול להיות בקלות ובדייקנות מבוים על …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי לאומי כללי לרפואה למדעי של מכוני הבריאות הלאומיים דרך מעניקה 5P20GM103636-02 (כולל Flow Cytometry תמיכה הליבה) ו- 1R01GM121703, וכן פרסים מהמרכז אוקלהומה עבור תאי גזע בוגרים מחקר.
Materials
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C79-500 | |
| MgSO4 | EMD Millipore | MMX00701 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | protease solution |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D1408 | |
| Ethanol (EtOH) | KOPTEC | V1016 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9647-100G | |
| Propidium Iodide (PI) | Invitrogen | P3566 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| EDTA | Sigma | E9844 | |
| SDS | Santa Cruz | sc-24950 | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Phenol:Chloroform | Sigma | P3803-100ML | |
| Sodium acetate | J.T.Baker | 3470 | |
| Glycogen | Ambion | AM9510 | |
| RNase A | Thermo Scientific | EN0531 | |
| Quanit-iT | Invitrogen | Q33130 | Reagents for fluorescence-based DNA quantification |
| Covaris AFA microTUBE | Covaris | 520045 | specialized tube for sonication |
| Covaris E220 Sonicator | Covaris | E220 | focused ultrasonicator |
| Agilent 4200 Tapestation | Agilent | G2991AA | automated electrophoresis machine |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | Reagents for automated electrophoresis machine |
| NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | Cat#E7370L | DNA library preparation kit |
| NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 1) | NEB | Cat#E7335S | multiplex oligos for DNA library preparation kit |
| NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 2) | NEB | Cat#E7500S | additional multiplex oligos for DNA library preparation kit |
| NEBNext Library Quant Kit for Illumina | NEB | E7630L | quantification kit for library preparation |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63882 | magnetic beads |
| Illumina HiSeq 2500 | Illumina | SY–401–2501 | next generation DNA sequencing platform |
| 40 µm Falcon Nylon Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| VWR Disposable Petri Dish 100 x 25 mm | VWR | 89107-632 | |
| 6.0 mL Syringe for Nichiryo Model 8100 | VWR | 89078-446 | |
| Posi-Click Tubes, 1.7 mL, Natural Color | Denville Scientific | C2170 (1001002) | Dnase/Rnase free |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Wash Bottles | VWR | 16650-022 | Low-Density Polyethylene, Wide Mouth |
| Strainer | VWR | 470092-440 | 6.9 cm, fine mesh |
| Corssing tank | Aquaneering | ZHCT100 | individual breeding tank |
| iSpawn | Techniplast | N/A | large breeding tank |
| FACSAria II | BD biosciences | N/A | cell sorting machine |
| Wild M5a steromicroscope | Wild Heerbrugg | N/A | dissecting microscope |
| Qubit 3 Fluorometer | Thermo Scientific | Q33216 | quantitative fluorescence-based method for determining DNA concentration |
| Matlab | Mathworks | version 2017a | |
| Matlab Statistics Toolbox | Mathworks | version 11.1 | |
| Matlab Curve Fitting Toolbox | Mathworks | version 3.5.5 |
References
- Rhind, N., Gilbert, D. M. DNA replication timing. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (8), a010132 (2013).
- Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
- Rivera-Mulia, J. C., et al. Dynamic changes in replication timing and gene expression during lineage specification of human pluripotent stem cells. Genome Res. 25 (8), 1091-1103 (2015).
- Hiratani, I., et al. Global reorganization of replication domains during embryonic stem cell differentiation. PLoS Biol. 6 (10), e245 (2008).
- Hiratani, I., et al. Genome-wide dynamics of replication timing revealed by in vitro models of mouse embryogenesis. Genome Res. 20 (2), 155-169 (2010).
- Koren, A., et al. Differential relationship of DNA replication timing to different forms of human mutation and variation. Am J Hum Genet. 91 (6), 1033-1040 (2012).
- Ryba, T., et al. Abnormal developmental control of replication-timing domains in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Genome Res. 22 (10), 1833-1844 (2012).
- Sima, J., Gilbert, D. M. Complex correlations: replication timing and mutational landscapes during cancer and genome evolution. Curr Opin Genet Dev. 25, 93-100 (2014).
- Veldman, M. B., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatr Res. 64 (5), 470-476 (2008).
- Link, B. A., Megason, S. G. Zebrafish as a Model for Development. Sourcebook of Models for Biomedical Research. , 103-112 (2008).
- Siefert, J. C., Clowdus, E. A., Sansam, C. L. Cell cycle control in the early embryonic development of aquatic animal species. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 178, 8-15 (2015).
- Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicol Sci. 86 (1), 6-19 (2005).
- Dooley, K., Zon, L. I. Zebrafish: a model system for the study of human disease. Curr Opin Genet Dev. 10 (3), 252-256 (2000).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122 (7), 2337-2343 (2012).
- Siefert, J. C., Georgescu, C., Wren, J. D., Koren, A., Sansam, C. L. DNA replication timing during development anticipates transcriptional programs and parallels enhancer activation. Genome Res. 27 (8), 1406-1416 (2017).
- Koren, A., et al. Genetic variation in human DNA replication timing. Cell. 159 (5), 1015-1026 (2014).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
