Zebra balığı bir Vivo içinde Model sistemi olarak kullanarak DNA çoğaltma zamanlaması profil oluşturma
Summary
Zebra balığı son kullanılan bir vivo içinde modeli sistemi olarak DNA çoğaltma zamanlaması geliştirme sırasında çalışmaya. İşte Zebra balığı embriyo profili çoğaltma zamanlaması için kullanarak iletişim kurallarını ayrıntılı. Bu iletişim kuralı kolayca çoğaltma zamanlaması mutantlar, tek hücre türleri, hastalık modelleri ve diğer türler çalışmaya adapte edilebilir.
Abstract
DNA çoğaltma zamanlaması Kromatin yapısı, transkripsiyon ve DNA mutasyon oranları önemli ilişkiler sergileyen bir önemli hücresel özelliği olduğunu. Geliştirme sırasında ve kanser, çoğaltma zamanlaması değişiklikler gerçekleşir ama gelişiminde rolü çoğaltma zamanlaması çalış ve hastalık olmadığı bilinmiyor. Zebra balığı son zamanlarda çoğaltma zamanlaması çalışmaya vivo içinde modeli sistemi kuruldu. İşte Zebra balığı DNA çoğaltma zamanlaması belirlemek için olacak kullanarak iletişim kurallarını ayrıntılı. Embriyo ve yetişkin Zebra balığı hücrelerden sıraladıktan sonra yüksek çözünürlüklü genom çapında DNA çoğaltma zamanlaması desenleri DNA kopya sayısı sonraki nesil sıralama veri analizi ile değişiklikler belirlenerek oluşturulabilir. Zebra balığı modeli sistemi içinde geliştirme vivo ortaya ve değişiklikleri tek tek hücre tipleri, hastalık modelleri ve mutant hattındaki değerlendirmek için de kullanılabilir çoğaltma zamanlaması değişiklikleri değerlendirilmesi için izin verir. Bu yöntemler çalışmalar araştırma geliştirme sırasında mekanizmaları ve çoğaltma zamanlaması kuruluş ve bakım belirleyicileri olanak tanır, mutasyonlar ve tumorigenesis ve perturbing etkileri rolü çoğaltma zamanlaması çalış çoğaltma zamanlamasını geliştirme ve hastalık.
Introduction
Başarılı bir şekilde bölmek hücreler için onlar ilk doğru ve sadakatle tüm onların genom çoğaltması gerekir. DNA çoğaltma zamanlama programı1olarak bilinen bir tekrarlanabilir model genom çoğaltma oluşur. DNA çoğaltma zamanlaması Kromatin organizasyon, epigenetik işaretleri ve gen ifade2,3ile ilişkilidir. Çoğaltma zamanlaması değişiklikleri geliştirme ortaya ve Kromatin işaretleri ve organizasyon4,5için değişiklik ve transkripsiyon için önemli ölçüde ilgili programlar vardır. Ayrıca, çoğaltma zamanlaması mutational frekansları ile ilişkilidir ve kanser6,7,8çeşitli zamanlama değişimler gözlenmektedir. Bu gözlemler rağmen mekanizmaları ve çoğaltma zamanlaması kuruluş ve yönetmelik belirleyicileri hala büyük ölçüde bilinmeyen ve bu gelişmede rol ve belirsiz bir hastalıktır. Ayrıca, son zamanlarda genom çapında çoğaltma kadar omurgalı geliştirme meydana gelen değişiklikler zamanlama yalnızca hücre kültür modellerinde muayene.
Zebra balığı, Danio rerio, geliştirme sırasında çoğaltma zamanlaması vivo içinde çalışmaya uygun olarak tek bir çiftleşme çift, geliştirmek embriyolar yüzlerce memeli geliştirme9birçok benzerlikler ile hızla yol açabilir, 10. Ayrıca, Zebra balığı geliştirme, hücre döngüsü, Kromatin organizasyon ve ilişkileri DNA çoğaltma zamanlaması11ile paylaşan transkripsiyon programları değişiklik vardır. Zebra balığı da mükemmel bir genetik model özellikle transgenesis, mutagenesis ve hedeflenen mutasyonlar tarafından manipülasyon için mükellef olduklarını, ve vardır birçok genlerin omurgalı geliştirme12için gerekli genetik ekranlar belirledik. Bu nedenle, Zebra balığı genler çoğaltma zamanlaması kuruluş ve bakım dahil tanımlamak ve çoğaltma zamanlaması omurgalı geliştirme yapmak etkilerini gözlemlemek için kullanılabilir. Transgenik satırları tek tek hücre tipleri, farklı gelişim timepoints veya hastalık ortamlarda izole üzerinden çoğaltma zamanlaması değerlendirmek için kullanılabilir. Önemlisi, çoğaltma zamanlaması, hastalık oluşumu ve ilerleme9,13,–14rolünü araştırmak için kullanılan insan hastalık çeşitli Zebra balığı modelleri vardır.
Son zamanlarda, ilk çoğaltma zamanlaması profilleri Zebra balığı vivo içinde15zamanlama çoğaltma çalışma modeli sistemi kurulması, oluşturulan. Bunu yapmak için hücreleri Zebra balığı embriyo gelişimi ve yetişkin Zebra balığı izole bir hücreye birden fazla aşamalarında toplanmıştır. Hücreleri sonra G1 ve S faz popülasyonlar izole etmek için DNA içeriğine göre (floresan aktif hücre sıralama) FACS tarafından sıralanır. G1 örnek kopya numarası denetimi olarak kullanarak, numara varyasyonları nüfus tespit ve göreli çoğaltma zamanlaması16anlaması için kullanılan S aşamasında kopyalayın. Çoğaltma zamanlaması değişiklikleri daha sonra doğrudan farklı gelişim örnekleri ve hücre tipleri arasında karşılaştırılabilir ve bu vivo omurgalı geliştirme boyunca oluşan çoğaltma zamanlaması değişiklikleri belirlemek için kullanılmıştır. Bu yöntem esas bu timidin analogları veya DNA4,6immunoprecipitation ile etiketleme gerektirmez genomik diğer yöntemler üzerinde birçok avantaj sunar.
İşte profil genom çapında DNA çoğaltma zamanlaması, iletişim kurallarını ayrıntılı yüksek çözünürlüklü Zebra balığı. Bu protokoller geliştirme oluşan bu ilişkiler değişimler profil oluşturma yanı sıra, Zebra balığı genom genomik ve epigenetik özellikleri ile ilişkileri belirlemek için kullanılmıştır. Bu iletişim kuralları da kolayca değişiklikler çoğaltma zamanlaması Zebra balığı mutant suşu ve hastalık modelleri çalışmaya adapte. Buna ek olarak, bu yöntemleri üzerine çoğaltma zamanlaması belirli hücre türleri, Zebra balığı tek hücre türlerinden ilk sıralama tarafından çalışma için genişletilebilir bir temel sağlar. Zebra balığı çoğaltma zamanlaması çalışmaya ve sonuçta bu önemli epigenetik özellik biyolojik fonksiyonları ortaya çıkarmak için bir mükemmel vivo içinde modeli sistemi olarak hizmet verebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebra balığı DNA çoğaltma zamanlaması eğitim için yeni ve benzersiz vivo içinde modeli sistemi sağlar. Ne zaman zamanlanmış matings olarak yapılmaktadır bu deneysel protokol için ayrıntılı, embriyo binlerce deneyler için tek bir gün içinde toplanabilir. Bu embriyoların zaman uyumlu olarak tam zamanlı ve net olarak karakterize aşamalarında gelişme geliştirmek. Zebra balığı kolayca ve doğru bir şekilde Zebra balığı embriyo dışarıdan geliştirmek ve optik net gibi bir stereomic…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser tarafından desteklenen Ulusal Enstitüsü genel tıbbi Bilimler Ulusal Sağlık Enstitüleri ile 5P20GM103636-02 (dahil Akış Sitometresi çekirdek desteği) ve 1R01GM121703 verir, hem de erişkin kök hücre için Oklahoma Merkezi’nden Ödülleri Araştırma.
Materials
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C79-500 | |
| MgSO4 | EMD Millipore | MMX00701 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | protease solution |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D1408 | |
| Ethanol (EtOH) | KOPTEC | V1016 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9647-100G | |
| Propidium Iodide (PI) | Invitrogen | P3566 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| EDTA | Sigma | E9844 | |
| SDS | Santa Cruz | sc-24950 | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Phenol:Chloroform | Sigma | P3803-100ML | |
| Sodium acetate | J.T.Baker | 3470 | |
| Glycogen | Ambion | AM9510 | |
| RNase A | Thermo Scientific | EN0531 | |
| Quanit-iT | Invitrogen | Q33130 | Reagents for fluorescence-based DNA quantification |
| Covaris AFA microTUBE | Covaris | 520045 | specialized tube for sonication |
| Covaris E220 Sonicator | Covaris | E220 | focused ultrasonicator |
| Agilent 4200 Tapestation | Agilent | G2991AA | automated electrophoresis machine |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | Reagents for automated electrophoresis machine |
| NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | Cat#E7370L | DNA library preparation kit |
| NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 1) | NEB | Cat#E7335S | multiplex oligos for DNA library preparation kit |
| NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 2) | NEB | Cat#E7500S | additional multiplex oligos for DNA library preparation kit |
| NEBNext Library Quant Kit for Illumina | NEB | E7630L | quantification kit for library preparation |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63882 | magnetic beads |
| Illumina HiSeq 2500 | Illumina | SY–401–2501 | next generation DNA sequencing platform |
| 40 µm Falcon Nylon Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| VWR Disposable Petri Dish 100 x 25 mm | VWR | 89107-632 | |
| 6.0 mL Syringe for Nichiryo Model 8100 | VWR | 89078-446 | |
| Posi-Click Tubes, 1.7 mL, Natural Color | Denville Scientific | C2170 (1001002) | Dnase/Rnase free |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Wash Bottles | VWR | 16650-022 | Low-Density Polyethylene, Wide Mouth |
| Strainer | VWR | 470092-440 | 6.9 cm, fine mesh |
| Corssing tank | Aquaneering | ZHCT100 | individual breeding tank |
| iSpawn | Techniplast | N/A | large breeding tank |
| FACSAria II | BD biosciences | N/A | cell sorting machine |
| Wild M5a steromicroscope | Wild Heerbrugg | N/A | dissecting microscope |
| Qubit 3 Fluorometer | Thermo Scientific | Q33216 | quantitative fluorescence-based method for determining DNA concentration |
| Matlab | Mathworks | version 2017a | |
| Matlab Statistics Toolbox | Mathworks | version 11.1 | |
| Matlab Curve Fitting Toolbox | Mathworks | version 3.5.5 |
References
- Rhind, N., Gilbert, D. M. DNA replication timing. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (8), a010132 (2013).
- Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
- Rivera-Mulia, J. C., et al. Dynamic changes in replication timing and gene expression during lineage specification of human pluripotent stem cells. Genome Res. 25 (8), 1091-1103 (2015).
- Hiratani, I., et al. Global reorganization of replication domains during embryonic stem cell differentiation. PLoS Biol. 6 (10), e245 (2008).
- Hiratani, I., et al. Genome-wide dynamics of replication timing revealed by in vitro models of mouse embryogenesis. Genome Res. 20 (2), 155-169 (2010).
- Koren, A., et al. Differential relationship of DNA replication timing to different forms of human mutation and variation. Am J Hum Genet. 91 (6), 1033-1040 (2012).
- Ryba, T., et al. Abnormal developmental control of replication-timing domains in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Genome Res. 22 (10), 1833-1844 (2012).
- Sima, J., Gilbert, D. M. Complex correlations: replication timing and mutational landscapes during cancer and genome evolution. Curr Opin Genet Dev. 25, 93-100 (2014).
- Veldman, M. B., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatr Res. 64 (5), 470-476 (2008).
- Link, B. A., Megason, S. G. Zebrafish as a Model for Development. Sourcebook of Models for Biomedical Research. , 103-112 (2008).
- Siefert, J. C., Clowdus, E. A., Sansam, C. L. Cell cycle control in the early embryonic development of aquatic animal species. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 178, 8-15 (2015).
- Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicol Sci. 86 (1), 6-19 (2005).
- Dooley, K., Zon, L. I. Zebrafish: a model system for the study of human disease. Curr Opin Genet Dev. 10 (3), 252-256 (2000).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122 (7), 2337-2343 (2012).
- Siefert, J. C., Georgescu, C., Wren, J. D., Koren, A., Sansam, C. L. DNA replication timing during development anticipates transcriptional programs and parallels enhancer activation. Genome Res. 27 (8), 1406-1416 (2017).
- Koren, A., et al. Genetic variation in human DNA replication timing. Cell. 159 (5), 1015-1026 (2014).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
