Profilering DNA replikering Timing bruker sebrafisk som en In Vivo modellsystem
Summary
Sebrafisk ble sist brukt som et i vivo modellsystem for å studere DNA replikering timing under utvikling. Her er detaljert protokollene for bruker sebrafisk embryo til profil replikering timing. Denne protokollen kan enkelt tilpasses for å studere replikering timing i mutanter, personlige celletyper, sykdom modeller og andre arter.
Abstract
DNA replikering timingen er en viktig mobilnettet karakteristiske, viser betydelige forbindelser med chromatin struktur, transkripsjon og DNA mutasjon priser. Endringer i replikering timing oppstå under utvikling og i kreft, men rollen replikering tidspunktet spiller i utvikling og sykdom er ikke kjent. Sebrafisk ble nylig etablert som et i vivo modellsystem å studere replikering timing. Her er detaljert protokollene for bruker sebrafisk for å avgjøre DNA replikering timing. Etter sortering celler fra embryo og voksen sebrafisk, kan høyoppløselig genomet hele DNA replikering timing mønstre konstrueres ved å bestemme DNA kopi tallet gjennom analyse av neste generasjons sekvensering data endres. Sebrafisk modell systemet tillater evaluering replikering timing endringer som oppstår i vivo gjennom utvikling, og kan også brukes til å vurdere endringer i enkelte celletyper, sykdom modeller eller mutant linjer. Disse metodene vil gjøre studier undersøke mekanismer og determinanter av replikering timing etableringen og vedlikeholdet under utvikling, rolle replikering tidspunktet spiller i mutasjoner tumorigenesis og effekten av perturbing replikering timing på utvikling og sykdom.
Introduction
For celler med hell dele, må de først nøyaktig og trofast gjenskape deres hele genom. Genomet duplisering oppstår i et gjentagende mønster, kjent som DNA replikering timing programmet1. DNA replikering timing er korrelert med chromatin organisasjonen, epigenetic merker og gene expression2,3. Endringer i replikering timing oppstår gjennom utvikling, og er vesentlig relatert til transcriptional programmer og endringer chromatin merker og organisasjon4,5. Videre replikering timing er korrelert med mutational frekvenser, og endringer i timing er observert i ulike typer kreft6,7,8. Til tross for disse observasjonene, mekanismer og determinanter av replikering timing etablering og regulering er fortsatt hovedsakelig ukjent, og rollen den spiller i utvikling og sykdom er ikke fastslått. I tillegg til nylig genomet hele replikering hadde timing endringer som skjer gjennom hele virveldyrenes utvikling bare blitt undersøkt i celle kultur modeller.
Sebrafisk, Danio rerio, er godt egnet til å studere replikering timing i vivo under utvikling, som en enkelt parring par kan gi hundrevis av embryo som utvikler raskt med mange likhetstrekk til pattedyr utvikling9, 10. Videre gjennom sebrafisk utvikling er det endringer i cellen syklus, chromatin organisasjonen og transcriptional programmer deler relasjoner med DNA replikering timing11. Sebrafisk er også en utmerket genetisk modell, som de er spesielt mottagelig for manipulering av transgenesis, mutagenese og målrettet mutasjoner, og genetisk skjermer har identifisert mange gener kreves for virveldyrenes utvikling12. Sebrafisk kan derfor brukes til å identifisere tilblivelse involvert inne replikering timing etableringen og vedlikeholdet og observere effekten av deregulating replikering timing på virveldyrenes utvikling. Transgene linjer kan også brukes til å vurdere replikering timing fra personlige celletyper isolert på ulike utviklingsmessige timepoints eller sykdom forhold. Viktigere, finnes det ulike sebrafisk modeller for menneskelig sykdom som kan brukes til å undersøke hvilken rolle replikering timing i sykdom dannelse og progresjon9,13,14.
Nylig ble første replikering timing profilene generert fra sebrafisk, etablere det som en modell å studere replikering timing i vivo15. Dette ble celler samlet fra sebrafisk embryo på flere stadier av utvikling og en celle type isolert fra voksen sebrafisk. Cellene ble deretter sortert etter FACS (fluorescens-aktivert celle sortering) basert på DNA innhold å isolere G1 og S fase bestander. Bruker G1 prøven som en kopi nummer, kopiere antall variasjoner i S fase bestander var bestemt og brukes til å antyde relative replikering timing16. Endringer i replikering timing kan deretter være direkte forhold mellom forskjellige utviklingsmessige prøver og celletyper og dette ble brukt til å angi endringer i replikering timing som oppstår i vivo gjennom virveldyrenes utvikling. Denne metoden gir flere fordeler sammenlignet med andre genomisk metoder, hovedsakelig at det ikke krever merking med thymidine analogs eller immunoprecipitation DNA4,6.
Her er detaljert protokollene profil genomet hele DNA replikering beregner for høy oppløsning i sebrafisk. Disse protokollene har blitt brukt til å bestemme relasjoner med genomisk og epigenetic funksjoner i sebrafisk genomet, samt profilering endringer i disse forholdene som skjer gjennom hele utvikling. Disse protokollene er også tilpasset for å studere endringer i replikering timing mutant stammer av sebrafisk og sykdom modeller. I tillegg gir disse metodene et grunnlag som kan utvides ved for å studere replikering timing i spesifikke celletyper, av første sortering ut de individuelle celletyper fra sebrafisk. Sebrafisk kan tjene som et utmerket i vivo modellsystem å studere replikering timing og til slutt avslører biologiske funksjonene til denne viktige epigenetic personlighetstrekk.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sebrafisk gi et nytt og unikt i vivo modellsystem å studere DNA replikering timing. Når tidsbestemt parring utføres som beskrevet i denne eksperimentelle protokollen, tusenvis av embryo kan samles i en eneste dag for eksperimenter. Disse Foster utvikle synkront gjennom nøyaktig timet og tydelig preget stadier av utviklingen. Sebrafisk kan være enkelt og nøyaktig iscenesatt av morfologi bruker en stereomicroscope, som sebrafisk embryo utvikle eksternt og er optisk helt. Denne protokollen detaljer bruk av se…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Institute of General Medical Sciences av National Institutes of Health gjennom tilskudd 5P20GM103636-02 (inkludert Flow cytometri kjernestøtte) og 1R01GM121703, i tillegg til priser fra Oklahoma Center for Adult Stem Cell Forskning.
Materials
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C79-500 | |
| MgSO4 | EMD Millipore | MMX00701 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | protease solution |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D1408 | |
| Ethanol (EtOH) | KOPTEC | V1016 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9647-100G | |
| Propidium Iodide (PI) | Invitrogen | P3566 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| EDTA | Sigma | E9844 | |
| SDS | Santa Cruz | sc-24950 | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Phenol:Chloroform | Sigma | P3803-100ML | |
| Sodium acetate | J.T.Baker | 3470 | |
| Glycogen | Ambion | AM9510 | |
| RNase A | Thermo Scientific | EN0531 | |
| Quanit-iT | Invitrogen | Q33130 | Reagents for fluorescence-based DNA quantification |
| Covaris AFA microTUBE | Covaris | 520045 | specialized tube for sonication |
| Covaris E220 Sonicator | Covaris | E220 | focused ultrasonicator |
| Agilent 4200 Tapestation | Agilent | G2991AA | automated electrophoresis machine |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | Reagents for automated electrophoresis machine |
| NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | Cat#E7370L | DNA library preparation kit |
| NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 1) | NEB | Cat#E7335S | multiplex oligos for DNA library preparation kit |
| NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 2) | NEB | Cat#E7500S | additional multiplex oligos for DNA library preparation kit |
| NEBNext Library Quant Kit for Illumina | NEB | E7630L | quantification kit for library preparation |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63882 | magnetic beads |
| Illumina HiSeq 2500 | Illumina | SY–401–2501 | next generation DNA sequencing platform |
| 40 µm Falcon Nylon Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| VWR Disposable Petri Dish 100 x 25 mm | VWR | 89107-632 | |
| 6.0 mL Syringe for Nichiryo Model 8100 | VWR | 89078-446 | |
| Posi-Click Tubes, 1.7 mL, Natural Color | Denville Scientific | C2170 (1001002) | Dnase/Rnase free |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Wash Bottles | VWR | 16650-022 | Low-Density Polyethylene, Wide Mouth |
| Strainer | VWR | 470092-440 | 6.9 cm, fine mesh |
| Corssing tank | Aquaneering | ZHCT100 | individual breeding tank |
| iSpawn | Techniplast | N/A | large breeding tank |
| FACSAria II | BD biosciences | N/A | cell sorting machine |
| Wild M5a steromicroscope | Wild Heerbrugg | N/A | dissecting microscope |
| Qubit 3 Fluorometer | Thermo Scientific | Q33216 | quantitative fluorescence-based method for determining DNA concentration |
| Matlab | Mathworks | version 2017a | |
| Matlab Statistics Toolbox | Mathworks | version 11.1 | |
| Matlab Curve Fitting Toolbox | Mathworks | version 3.5.5 |
References
- Rhind, N., Gilbert, D. M. DNA replication timing. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (8), a010132 (2013).
- Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
- Rivera-Mulia, J. C., et al. Dynamic changes in replication timing and gene expression during lineage specification of human pluripotent stem cells. Genome Res. 25 (8), 1091-1103 (2015).
- Hiratani, I., et al. Global reorganization of replication domains during embryonic stem cell differentiation. PLoS Biol. 6 (10), e245 (2008).
- Hiratani, I., et al. Genome-wide dynamics of replication timing revealed by in vitro models of mouse embryogenesis. Genome Res. 20 (2), 155-169 (2010).
- Koren, A., et al. Differential relationship of DNA replication timing to different forms of human mutation and variation. Am J Hum Genet. 91 (6), 1033-1040 (2012).
- Ryba, T., et al. Abnormal developmental control of replication-timing domains in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Genome Res. 22 (10), 1833-1844 (2012).
- Sima, J., Gilbert, D. M. Complex correlations: replication timing and mutational landscapes during cancer and genome evolution. Curr Opin Genet Dev. 25, 93-100 (2014).
- Veldman, M. B., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatr Res. 64 (5), 470-476 (2008).
- Link, B. A., Megason, S. G. Zebrafish as a Model for Development. Sourcebook of Models for Biomedical Research. , 103-112 (2008).
- Siefert, J. C., Clowdus, E. A., Sansam, C. L. Cell cycle control in the early embryonic development of aquatic animal species. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 178, 8-15 (2015).
- Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicol Sci. 86 (1), 6-19 (2005).
- Dooley, K., Zon, L. I. Zebrafish: a model system for the study of human disease. Curr Opin Genet Dev. 10 (3), 252-256 (2000).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122 (7), 2337-2343 (2012).
- Siefert, J. C., Georgescu, C., Wren, J. D., Koren, A., Sansam, C. L. DNA replication timing during development anticipates transcriptional programs and parallels enhancer activation. Genome Res. 27 (8), 1406-1416 (2017).
- Koren, A., et al. Genetic variation in human DNA replication timing. Cell. 159 (5), 1015-1026 (2014).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
