Um método para a medição da função da glândula salivar em ratos

Summary

Hipofunção das glândulas salivares é uma consequência frequente da terapia de radiação e doença auto-imune. Reprodutível avaliação da função da glândula salivar em modelos do rato destas doenças é um desafio técnico. Aqui, um método simples para a medição exata e reproduzível da produção de saliva em camundongos é descrito.

Abstract

Pacientes com síndrome de Sjögren, uma doença auto-imune que afectam as glândulas exócrinas, desenvolvem a inflamação das glândulas salivares e reduziram a produção de saliva. Da mesma forma, a produção de saliva é severamente comprometida em pacientes recebendo tratamento com radiação para câncer de cabeça e pescoço. Modelos de roedores, desenvolvidos para imitar essas condições clínicas, facilitam uma compreensão da patogênese da doença e permitam o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. Portanto, a capacidade de precisão reproducibly e repetidamente medir a função da glândula salivar em modelos animais é crítica. Base em procedimentos previamente descritos na literatura, um método foi desenvolvido que atende a esses critérios e foi utilizado para avaliar a função da glândula salivar em camundongos. Uma vantagem adicional deste novo método é que ele é facilmente dominado e tem pouca variação inter operador. Função da glândula salivar é avaliada como a quantidade (volume ou peso) ou taxa (mL/min) de saliva produzida em resposta à estimulação de pilocarpina. A saliva coletada é uma boa fonte para as análises do teor de proteínas, as concentrações de imunoglobulinas e outras biomoléculas.

Introduction

As glândulas salivares produzem saliva em resposta a uma variedade de estímulos neurológicos e mecânica¹. Os estímulos são transportados através do sistema nervoso simpático e parassimpático aos receptores adrenérgicos e colinérgicos na glândula. Pilocarpina é um agente colinérgico, Pará-simpaticomimética que atua predominantemente sobre os receptores muscarínicos. Na glândula salivar, que induz a produção de saliva, agindo sobre os receptores de acetilcolina muscarínicos M3¹. Produção de saliva, após a administração de pilocarpina é um indicador da capacidade de responder à estimulação das glândulas salivares e é comumente usada como uma medida da função da glândula salivar.

Medição da produção de saliva é fundamental no estudo de doenças das glândulas salivares, incluindo Síndrome de Sjögren² e lesão de radiação de tratamento de câncer cabeça e pescoço³a seguir. Diversos métodos foram desenvolvidos para medir a produção de saliva em roedores. Estes incluem canulação direta do Ducto excretor salivar⁴, coleta de saliva da cavidade oral sob vácuo⁵e coleção usando de capilares de vidro⁶ ou^7,uma micropipeta,^{8, 9}. direto a canulação do ducto salivar fornece saliva mais preciso e puro. No entanto, este é um procedimento tecnicamente desafiador, e o potencial para causar lesão ductal impede a coleções de saliva repetitiva do mesmo animal. Coleta de saliva sob vácuo pode levar a resultados variáveis devido à secagem da saliva do tubo. Esta perda é mais exagerada em camundongos com salivação reduzida. Capilares de vidro permitem a coleta de saliva para análises subsequentes, no entanto, as alterações na viscosidade da saliva secretada no estado doente impede enchimento eficiente do capilar. Além disso, as tentativas de varrer a cavidade oral para coletar saliva residual podem causar ferimentos. O método de pipeta permite a coleção completa, e para o mesmo operador, é notavelmente consistente entre as experiências. No entanto, por razões desconhecidas, esse método mostra uma variação significativa entre os diferentes operadores. Portanto, para permitir comparações apropriadas, torna-se imperativo que o mesmo operador realiza todas as experiências relacionadas a um projeto específico. Claramente, isto representa uma grande desvantagem para um laboratório.

Para superar esses problemas, um procedimento foi desenvolvido que combina métodos de recolha de saliva usada para seres humanos e roedores. O método da zaragatoa, descrito abaixo para medir o volume de saliva induzidas pela pilocarpina é simples, reprodutível, não influenciada pelo operador e pode ser executado repetidamente no mesmo animal. Além disso, permite a coleta de saliva para posteriores análises de proteínas, imunoglobulinas ou outras biomoléculas.

Protocol

O protocolo descrito abaixo foi aprovado pelo Comitê de uso e cuidado institucional do Animal e segue as diretrizes éticas estabelecidas pelos institutos nacionais de saúde. Todos os dados apresentados neste relatório foram gerados usando ratos fêmeas que eram 10-12 semanas de idade. Foram utilizadas as seguintes cepas de ratos: C57BL/6, BALB/c, DBA1, 129S e F1 (B6XA/J). Todos os ratos foram alojados em gaiolas de barreira (5 animais por gaiola) em condições específicas isentos de organismos patogénicos e fornec…

Representative Results

Nos sistemas de modelo experimental do mouse, a capacidade de produzir saliva em resposta à estimulação de pilocarpina é usada como um indicador da função das glândulas salivares. Produção de saliva era medida em ratos fêmeas de C57BL/6 de 11 semanas de idade pelo método cotonete. Na figura 1A, os resultados são expressos como a quantidade de saliva (mg) coletado após doses crescentes de pilocarpina. Com a dose de 1 mg/kg de peso corporal, alguns…

Discussion

Produção de saliva é um processo complexo e é influenciada por muitos fatores. Portanto, medir a função da glândula salivar em animais de laboratório pode ser um desafio. Um desafio adicional é que medidas repetidas da função das glândulas salivares no mesmo animal são necessárias para estabelecer o início da doença ou para demonstrar a recuperação após o tratamento.

O método da zaragatoa descrito neste relatório é tecnicamente simples para realizar com várias opções p…

Materials

Chemicals for saliva collection
Pilocarpine hydrochloride	Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA	B21410	Dilute in sterile isotonic saline. Store single use aliquots of 100X stock at -80oC
Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia Mix solution			Mix 1 mL ketamine hydrochloride + 0.5 mL xylazine + 8.5 mL sterile isotonic saline in a sterile vial. Can be used for 3 months.
Zetamine (Ketamine hydrochloride)	Vet One, Boise, Idaho, USA	C3N VT1	Stock is 100 mg/mL
Anased (Xylazine)	Med-Vet International, Mettawa, IL, USA	RXANASED-20	Stock is 20 mg/mL
Isotonic sterile saline	Vet One, Boise, Idaho, USA	501032	Used as diluent
Artificial tears (lubricant ophthalmic ointment)	Henry Schien, Dublin, OH, USA	48272	Used to prevent eyes from drying during the procedure
Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials for saliva collection
SalivaBio Children's swab	Salimetrics, LLC Carlsbad, CA, USA	N/A	Individually wrapped swabs
50 mL polypropylene tubes	VWR, Radnor, PA, USA	89004-364	Cut off the bottom 1 cm of the tube. Make sure that the cut edge is smooth.
Microcentrifuge tubes 0.6 mL	VWR, Radnor, PA, USA	87003-290	Make holes in the bottom of tube with heated 18 gauge needles
Microcentrifuge tubes 2 mL	VWR, Radnor, PA, USA	87003-298
Insulin Syringes with permanently attached needles	Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA	324702
18 gauge regular bevel needles	Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA	305195
Sterile scalpel blade #11	Integra York Inc PA, USA	4-311
Microdissecting forceps	Roboz, Gaithersburg, MD, USA	RS-5139	Serrated angular 0.8 mm tip, 4" length
Label tape	Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA	sc-224487
3 channel timer	Amazon.com, Seattle, WA, USA	B06W2KCYVN
Analytical Balance	Mettler Toledo, Columbus OH, USA
Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals/ reagents for inducing salivary dysfunction
LPS	Invivogen, San Deigo, CA, USA	tlrl-b5lps	Dissolve in endotoxin free water, and store stock solution at 5 mg/mL . dilute in sterile HBSS 100 ug/mL – inject 100 uL/ moue ip
Imject Alum adjuvant	Thermo Scientific	77161	Dilute 1:1 in sterile saline. Inject intraperitoneally 0.1 mL/mouse
Rabbit anti-Ro52 antiserum	Generated in lab		Immunization of rabbits with recombinant mouse Ro52
Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals/ Kits for saliva analyses
Salivary lysozyme estimation
EnzChek Lysozyme Assay Kit	Molecular Probes, Eugene, OR, USA	E-22013	Used as per manufacturer's instructions
Name	Company	Catalog Number	Comments
Salivary IgA estimation by sandwich ELISA
Mouse IgA	Southern Biotech, Birmingham, AL, USA	0106-01	Standards for sandwich ELISA – range 30 ng/mL to 0.5 ng/mL
Goat anti- mouse IgA unlabeled	Southern Biotech, Birmingham, AL, USA	1040-01	Coat at 1 ug/mL in bicarbonate buffer
Goat anti- mouse IgA HRP	Southern Biotech, Birmingham, AL, USA	1040-05	Detection antibody used at 1:4000 dilution
TMB substrate	Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA	555214	Used as per manufacturer's instructions
Immulon 4HBX Microtiter 96 well plates	Thermo Scientific, Rochester, NY, USA	3855
Name	Company	Catalog Number	Comments
Salivary protein estimation
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate	BioRad, Hercules, CA, USA	5000006	For protein estimation as per manufacturer's instructions