Tükürük bezi işlevi farelerde ölçülmesi için bir yöntem
Summary
Tükürük bezi hypofunction otoimmün hastalığı ve radyasyon terapisi sık bir sonucudur. Bu hastalıkların fare modellerinde Tükürük bezi ile tekrarlanabilir değerlendirilmesi teknik bir sorundur. Burada, tükürük üretim farelerde doğru ve tekrarlanabilir ölçüm için basit bir yöntem açıklanmıştır.
Abstract
Sjoegren Sendromu, ekzokrin bezleri etkileyen otoimmün bir hastalığı olan hastalarda Tükürük bezi iltihabı geliştirmek ve tükürük üretimi azalttı. Benzer şekilde, tükürük üretim ciddi baş ve boyun kanserlerinin için radyasyon tedavisi alan hastalarda güvenilir değil. Kemirgen modelleri, bu klinik durumlar ve taklit etmek için geliştirilen hastalık patogenezinde anlamayı kolaylaştırmak ve yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için izin verir. Bu nedenle, doğru tekrarlanarak ve art arda Tükürük bezi işlevi hayvan modellerinde ölçmek için kritik yeteneğidir. Literatürde daha önce açıklanan yordamları hakkında oluşturmak, bu kriterleri karşılayan ve tükürük bezi işlevi farelerde değerlendirmek için kullanılan bir yöntem geliştirilmiştir. Ek bir avantaj bu yeni yöntemin bu kolayca hakim ve küçük arası operatör varyasyon vardır olduğunu. Tükürük bezi işlevi miktar (ağırlık veya hacim) veya tükürük Pilokarpin stimülasyon üretti oranını (mL/dk) olarak değerlendirilir. Toplanan tükürük analizleri protein içeriği, immünglobulin konsantrasyonları ve diğer biomolecules için iyi bir kaynaktır.
Introduction
Tükürük bezlerinin tükürük yanıt olarak nörolojik ve mekanik uyaranlara1çeşitli üretmek. Uyaranlara için bezi adrenergic ve kolinerjik reseptörler sempatik ve parasempatik sinir sistemi aracılığıyla taşınır. Pilokarpin muscarinic reseptörleri üzerinde ağırlıklı olarak davranır kolinerjik, para sempatomimetik bir ajandır. Tükürük bezi bu muscarinic asetilkolin reseptörü M31üzerinde hareket ederek tükürük üretimini neden olmaktadır. Tükürük üretim Pilokarpin yönetim takip tükürük bezleri uyarmaya tepki yeteneğini bir göstergesidir ve tükürük bezi işlevi bir ölçüsü olarak yaygın olarak kullanılır.
Tükürük üretim doğru ölçüm Tükürük bezi hastalıkları Sjoegren Sendromu2 ve baş ve boyun kanser tedavi3takip radyasyon hasarı da dahil olmak üzere çalışma odasında önemlidir. Tükürük üretim Rodents ölçmek için birkaç farklı yöntem geliştirilmiştir. Bunlar doğrudan cannulation boşaltım tükürük kanal4, tükürük ağız boşluğu altında vakum5üzerinden topluluğu ve cam kılcal6 veya bir micropipette7,8, kullanarak toplama içerir 9. cannulation tükürük kanalının en doğru ve saf tükürük sağlar doğrudan. Ancak, bu teknik olarak zor bir işlemdir ve tekrarlayan tükürük koleksiyonları aynı hayvan duktal yaralanma neden için potansiyel engellemektedir. Vakum altında tükürük toplama tükürük tüp kurutma nedeniyle değişken sonuçları yol açabilir. Bu kaybı daha da indirimli salya ile farelerde abartılı olduğunu. Cam kılcal damarlar koleksiyonunu tükürük daha sonraki analizler için izin verir, ancak, viskozite hastalıklı durumda salgılanan tükürük değişimler kılcal verimli dolgu engeller. Ayrıca, artık tükürük toplamak için ağız boşluğu süpürme girişimlerini yaralanmalara yol açabilir. Damlalıklı yöntemi için tam toplama sağlar ve aynı işleci için deneyler arasında son derece tutarlı. Ancak, bilinmeyen nedenlerden dolayı bu yöntem farklı operatörler arasında önemli değişimleri gösterir. Bu nedenle, uygun karşılaştırma izin vermek için bu aynı işleç belirli bir projeyle ilgili tüm deneylerin gerçekleştirir şart olur. Açıkçası, bu bir laboratuvar için büyük bir dezavantaj temsil eder.
Bu sorunları aşmak için bir yordam birleştiren tükürük toplama yöntemleri insanlar ve kemirgen için kullanılan geliştirilmiştir. Tükürük Pilokarpin kaynaklı cilt ölçmek için aşağıda açıklanan çubukla yöntemi, operatör tarafından akıttıkları basit, tekrarlanabilir ve tekrar tekrar aynı hayvan gerçekleştirilebilir. Ayrıca, proteinler, immünglobulin veya diğer biomolecules daha sonraki analizler için tükürük toplama sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tükürük üretim karmaşık bir süreçtir ve birçok faktör tarafından etkilenir. Bu nedenle, Tükürük bezi işlevi laboratuvar hayvanlarda ölçme bir meydan okuma olabilir. Tükürük bezi fonksiyonunu kullanabilirsiniz aynı hayvan tekrarlanan ölçüler hastalığın başlangıcı kurmak için veya tedavi aşağıdaki kurtarma göstermek için gerekli olan bir ek mücadeledir.
Bu raporda açıklanan çubukla yöntem teknik olarak verileri göstermek için birden çok seçenek ile ge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Çalışma Ulusal Sağlık enstitüleri, Ulusal Enstitüsü diş ve Fasiyal araştırma (DE025030) bir hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Chemicals for saliva collection | |||
| Pilocarpine hydrochloride | Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA | B21410 | Dilute in sterile isotonic saline. Store single use aliquots of 100X stock at -80oC |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia Mix solution | Mix 1 mL ketamine hydrochloride + 0.5 mL xylazine + 8.5 mL sterile isotonic saline in a sterile vial. Can be used for 3 months. | ||
| Zetamine (Ketamine hydrochloride) | Vet One, Boise, Idaho, USA | C3N VT1 | Stock is 100 mg/mL |
| Anased (Xylazine) | Med-Vet International, Mettawa, IL, USA | RXANASED-20 | Stock is 20 mg/mL |
| Isotonic sterile saline | Vet One, Boise, Idaho, USA | 501032 | Used as diluent |
| Artificial tears (lubricant ophthalmic ointment) | Henry Schien, Dublin, OH, USA | 48272 | Used to prevent eyes from drying during the procedure |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials for saliva collection | |||
| SalivaBio Children's swab | Salimetrics, LLC Carlsbad, CA, USA | N/A | Individually wrapped swabs |
| 50 mL polypropylene tubes | VWR, Radnor, PA, USA | 89004-364 | Cut off the bottom 1 cm of the tube. Make sure that the cut edge is smooth. |
| Microcentrifuge tubes 0.6 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-290 | Make holes in the bottom of tube with heated 18 gauge needles |
| Microcentrifuge tubes 2 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-298 | |
| Insulin Syringes with permanently attached needles | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 324702 | |
| 18 gauge regular bevel needles | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 305195 | |
| Sterile scalpel blade #11 | Integra York Inc PA, USA | 4-311 | |
| Microdissecting forceps | Roboz, Gaithersburg, MD, USA | RS-5139 | Serrated angular 0.8 mm tip, 4" length |
| Label tape | Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA | sc-224487 | |
| 3 channel timer | Amazon.com, Seattle, WA, USA | B06W2KCYVN | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo, Columbus OH, USA | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals/ reagents for inducing salivary dysfunction | |||
| LPS | Invivogen, San Deigo, CA, USA | tlrl-b5lps | Dissolve in endotoxin free water, and store stock solution at 5 mg/mL . dilute in sterile HBSS 100 ug/mL – inject 100 uL/ moue ip |
| Imject Alum adjuvant | Thermo Scientific | 77161 | Dilute 1:1 in sterile saline. Inject intraperitoneally 0.1 mL/mouse |
| Rabbit anti-Ro52 antiserum | Generated in lab | Immunization of rabbits with recombinant mouse Ro52 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals/ Kits for saliva analyses | |||
| Salivary lysozyme estimation | |||
| EnzChek Lysozyme Assay Kit | Molecular Probes, Eugene, OR, USA | E-22013 | Used as per manufacturer's instructions |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Salivary IgA estimation by sandwich ELISA | |||
| Mouse IgA | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 0106-01 | Standards for sandwich ELISA – range 30 ng/mL to 0.5 ng/mL |
| Goat anti- mouse IgA unlabeled | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-01 | Coat at 1 ug/mL in bicarbonate buffer |
| Goat anti- mouse IgA HRP | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-05 | Detection antibody used at 1:4000 dilution |
| TMB substrate | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 555214 | Used as per manufacturer's instructions |
| Immulon 4HBX Microtiter 96 well plates | Thermo Scientific, Rochester, NY, USA | 3855 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Salivary protein estimation | |||
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | BioRad, Hercules, CA, USA | 5000006 | For protein estimation as per manufacturer's instructions |
References
- Proctor, G. B. The physiology of salivary secretion. Periodontol 2000. 70 (1), 11-25 (2016).
- Fox, R. I. Sjögren’s syndrome. Lancet. 366 (9482), 321-331 (2005).
- Eisbruch, A., Kim, H. M., Terrell, J. E., Marsh, L. H., Dawson, L. A., Ship, J. A. Xerostomia and its predictors following parotid-sparing irradiation of head-and-neck cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 50 (3), 695-704 (2001).
- Marmary, Y., Fox, P. C., Baum, B. J. Fluid secretion rates from mouse and rat parotid glands are markedly different following pilocarpine stimulation. Comp Biochem Physiol A Comp Physiol. 88 (2), 307-310 (1987).
- Lin, A. L., Johnson, D. A., Wu, Y., Wong, G., Ebersole, J. L., Yeh, C. K. Measuring short-term gamma-irradiation effects on mouse salivary gland function using a new saliva collection device. Arch Oral Biol. 46 (11), 1085-1089 (2001).
- Scofield, R. H., Asfa, S., Obeso, D., Jonsson, R., Kurien, B. T. Immunization with short peptides from the 60-kDa Ro antigen recapitulates the serological and pathological findings as well as the salivary gland dysfunction of Sjogren’s syndrome. J Immunol. 175 (12), 8409-8414 (2005).
- Deshmukh, U. S., Nandula, S. R., Thimmalapura, P. R., Scindia, Y. M., Bagavant, H. Activation of innate immune responses through Toll-like receptor 3 causes a rapid loss of salivary gland function. J Oral Pathol Med. 38 (1), 42-47 (2009).
- Deshmukh, U. S., Ohyama, Y., Bagavant, H., Guo, X., Gaskin, F., Fu, S. M. Inflammatory stimuli accelerate Sjögren’s syndrome-like disease in (NZB x NZW)F1 mice. Arthritis Rheum. 58 (5), 1318-1323 (2008).
- Szczerba, B. M., et al. Interaction between innate immunity and Ro52-induced antibody causes Sjögren’s syndrome-like disorder in mice. Ann Rheum Dis. 75 (3), 617-622 (2016).
- Takakura, A., Moreira, T., Laitano, S., De Luca Júnior, L., Renzi, A., Menani, J. Central muscarinic receptors signal pilocarpine-induced salivation. J Dent Res. 82 (12), 993-997 (2003).
- Yao, C., et al. Lipopolysaccharide-induced elevation and secretion of interleukin-1beta in the submandibular gland of male mice. Immunology. 116 (2), 213-222 (2005).
- Knudsen, J., Nauntofte, B., Josipovic, M., Engelholm, S. A., Hyldegaard, O. Effects of isoflurane anesthesia and pilocarpine on rat parotid saliva flow. Radiat Res. 176 (1), 84-88 (2011).
- Kohrs, R., Durieux, M. E. Ketamine: teaching an old drug new tricks. Anesth Analg. 87 (5), 1186-1193 (1998).
- Kozaki, T., Hashiguchi, N., Kaji, Y., Yasukouchi, A., Tochihara, Y. Effects of saliva collection using cotton swab on cortisol enzyme immunoassay. Eur J Appl Physiol. 107 (6), 743-746 (2009).
