Метод для измерения функции слюнной железы у мышей
Summary
Гипофункция слюнных желез является частое следствие аутоиммунных заболеваний и лучевой терапии. Воспроизводимые оценки функции слюнных желез в моделях мыши этих заболеваний является технической проблемой. Здесь описан простой метод для точного и воспроизводимого измерения производства слюны у мышей.
Abstract
Больных с синдромом Шёгрен на, аутоиммунное заболевание, поражающее экзокринных желез, развивать слюнных желез воспаление и сократили производство слюны. Аналогично производство слюны серьезно подорваны у больных, получавших лучевой терапии рака головы и шеи. Грызунов модели, разработанные для имитации этих клинических условий, содействия пониманию патогенеза заболевания и позволяет для развития новых терапевтических стратегий. Таким образом способность точно, можно воспроизвести и неоднократно измерения функции слюнных желез в животных моделях имеет решающее значение. Опираясь на ранее описанные в литературе, был разработан метод который отвечает этим критериям и была использована для оценки функции слюнной железы у мышей. Дополнительным преимуществом этого нового метода является, что она осваивается легко и имеет небольшие отличия между оператором. Слюнные железы функция вычисляется как сумма (вес или объем) или ставка (мл/мин) слюны производства в ответ на стимуляцию пилокарпин. Собранные слюны является хорошим источником для анализа содержания белка, концентрации иммуноглобулина и других биомолекул.
Introduction
Слюнные железы вырабатывают слюну в ответ на различные неврологические и механических раздражителей1. Раздражители осуществляется через симпатическую и парасимпатическую нервную систему адренергических и холинергических рецепторов в железе. Пилокарпин — холинергических, пункт симпатомиметической агент, который действует преимущественно на мускариновых рецепторов. В слюнной железе он индуцирует выработку слюны, воздействуя на мускариновых ацетилхолиновый рецептор м31. Производство слюны, после пилокарпин администрации является показателем способности слюнных желез реагировать стимуляции и обычно используется как мера функции слюнных желез.
Точное измерение слюны производства имеет решающее значение в изучении слюнной железы болезней, включая синдром Шёгрен на2 и радиационной травмы после лечения рака головы и шеи3. Были разработаны несколько различных методов для измерения слюны у грызунов. К ним относятся прямые катетеризации выделительной Слюнных протоков4, сбора слюны из ротовой полости под вакуумной5и коллекции с помощью стеклянных капилляров6 или7,микропипеткой8, 9. прямой катетеризации Слюнных протоков предоставляет наиболее точную и чистой слюны. Однако это технически сложная процедура, и потенциал для причинения вреда протоковой исключает повторяющихся слюны коллекции от же животных. Сбора слюны под вакуумом может привести к переменной результаты из-за высыхания слюны из трубки. Далее эта потеря преувеличен в мышах с уменьшение слюноотделения. Стеклянные капилляры позволяют сбора слюны для последующего анализа, однако, изменения в вязкость слюны, секретируемых в состоянии больной предотвращает эффективное Заполнение капилляра. Кроме того попытки развертки полости для сбора остаточной слюны может привести к травме. Накапайте метод позволяет для полной коллекции, и за тот же оператор, это удивительно согласуется между экспериментов. Однако по неизвестным причинам, этот метод показывает значительные различия между различными операторами. Таким образом чтобы соответствующие сравнения, становится необходимым, что тот же оператор выполняет все эксперименты, связанные с конкретным проектом. Очевидно это является основным недостатком для лаборатории.
Преодолеть эти проблемы, была разработана процедура, что сочетает в себе методы сбора слюны используется для людей и грызунов. Тампоном, описанный ниже метод для измерения объема пилокарпин индуцированной слюны простой, воспроизводимость, не зависит от оператора и могут выполняться неоднократно в то же самое животное. Кроме того она позволяет сбора слюны для последующего анализа белков, иммуноглобулины или других биомолекул.
Protocol
Representative Results
Discussion
Слюны является сложным процессом и зависит от многих факторов. Таким образом измерения функции слюнных желез в лабораторных животных может быть проблемой. Дополнительной проблемой является то, что повторные измерения функции слюнных желез в то же самое животное необходимо установить…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грант от национальных институтов здравоохранения, Национальный Институт стоматологии и краниофациальных исследований (DE025030).
Materials
| Chemicals for saliva collection | |||
| Pilocarpine hydrochloride | Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA | B21410 | Dilute in sterile isotonic saline. Store single use aliquots of 100X stock at -80oC |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia Mix solution | Mix 1 mL ketamine hydrochloride + 0.5 mL xylazine + 8.5 mL sterile isotonic saline in a sterile vial. Can be used for 3 months. | ||
| Zetamine (Ketamine hydrochloride) | Vet One, Boise, Idaho, USA | C3N VT1 | Stock is 100 mg/mL |
| Anased (Xylazine) | Med-Vet International, Mettawa, IL, USA | RXANASED-20 | Stock is 20 mg/mL |
| Isotonic sterile saline | Vet One, Boise, Idaho, USA | 501032 | Used as diluent |
| Artificial tears (lubricant ophthalmic ointment) | Henry Schien, Dublin, OH, USA | 48272 | Used to prevent eyes from drying during the procedure |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials for saliva collection | |||
| SalivaBio Children's swab | Salimetrics, LLC Carlsbad, CA, USA | N/A | Individually wrapped swabs |
| 50 mL polypropylene tubes | VWR, Radnor, PA, USA | 89004-364 | Cut off the bottom 1 cm of the tube. Make sure that the cut edge is smooth. |
| Microcentrifuge tubes 0.6 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-290 | Make holes in the bottom of tube with heated 18 gauge needles |
| Microcentrifuge tubes 2 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-298 | |
| Insulin Syringes with permanently attached needles | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 324702 | |
| 18 gauge regular bevel needles | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 305195 | |
| Sterile scalpel blade #11 | Integra York Inc PA, USA | 4-311 | |
| Microdissecting forceps | Roboz, Gaithersburg, MD, USA | RS-5139 | Serrated angular 0.8 mm tip, 4" length |
| Label tape | Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA | sc-224487 | |
| 3 channel timer | Amazon.com, Seattle, WA, USA | B06W2KCYVN | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo, Columbus OH, USA | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals/ reagents for inducing salivary dysfunction | |||
| LPS | Invivogen, San Deigo, CA, USA | tlrl-b5lps | Dissolve in endotoxin free water, and store stock solution at 5 mg/mL . dilute in sterile HBSS 100 ug/mL – inject 100 uL/ moue ip |
| Imject Alum adjuvant | Thermo Scientific | 77161 | Dilute 1:1 in sterile saline. Inject intraperitoneally 0.1 mL/mouse |
| Rabbit anti-Ro52 antiserum | Generated in lab | Immunization of rabbits with recombinant mouse Ro52 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals/ Kits for saliva analyses | |||
| Salivary lysozyme estimation | |||
| EnzChek Lysozyme Assay Kit | Molecular Probes, Eugene, OR, USA | E-22013 | Used as per manufacturer's instructions |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Salivary IgA estimation by sandwich ELISA | |||
| Mouse IgA | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 0106-01 | Standards for sandwich ELISA – range 30 ng/mL to 0.5 ng/mL |
| Goat anti- mouse IgA unlabeled | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-01 | Coat at 1 ug/mL in bicarbonate buffer |
| Goat anti- mouse IgA HRP | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-05 | Detection antibody used at 1:4000 dilution |
| TMB substrate | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 555214 | Used as per manufacturer's instructions |
| Immulon 4HBX Microtiter 96 well plates | Thermo Scientific, Rochester, NY, USA | 3855 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Salivary protein estimation | |||
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | BioRad, Hercules, CA, USA | 5000006 | For protein estimation as per manufacturer's instructions |
References
- Proctor, G. B. The physiology of salivary secretion. Periodontol 2000. 70 (1), 11-25 (2016).
- Fox, R. I. Sjögren’s syndrome. Lancet. 366 (9482), 321-331 (2005).
- Eisbruch, A., Kim, H. M., Terrell, J. E., Marsh, L. H., Dawson, L. A., Ship, J. A. Xerostomia and its predictors following parotid-sparing irradiation of head-and-neck cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 50 (3), 695-704 (2001).
- Marmary, Y., Fox, P. C., Baum, B. J. Fluid secretion rates from mouse and rat parotid glands are markedly different following pilocarpine stimulation. Comp Biochem Physiol A Comp Physiol. 88 (2), 307-310 (1987).
- Lin, A. L., Johnson, D. A., Wu, Y., Wong, G., Ebersole, J. L., Yeh, C. K. Measuring short-term gamma-irradiation effects on mouse salivary gland function using a new saliva collection device. Arch Oral Biol. 46 (11), 1085-1089 (2001).
- Scofield, R. H., Asfa, S., Obeso, D., Jonsson, R., Kurien, B. T. Immunization with short peptides from the 60-kDa Ro antigen recapitulates the serological and pathological findings as well as the salivary gland dysfunction of Sjogren’s syndrome. J Immunol. 175 (12), 8409-8414 (2005).
- Deshmukh, U. S., Nandula, S. R., Thimmalapura, P. R., Scindia, Y. M., Bagavant, H. Activation of innate immune responses through Toll-like receptor 3 causes a rapid loss of salivary gland function. J Oral Pathol Med. 38 (1), 42-47 (2009).
- Deshmukh, U. S., Ohyama, Y., Bagavant, H., Guo, X., Gaskin, F., Fu, S. M. Inflammatory stimuli accelerate Sjögren’s syndrome-like disease in (NZB x NZW)F1 mice. Arthritis Rheum. 58 (5), 1318-1323 (2008).
- Szczerba, B. M., et al. Interaction between innate immunity and Ro52-induced antibody causes Sjögren’s syndrome-like disorder in mice. Ann Rheum Dis. 75 (3), 617-622 (2016).
- Takakura, A., Moreira, T., Laitano, S., De Luca Júnior, L., Renzi, A., Menani, J. Central muscarinic receptors signal pilocarpine-induced salivation. J Dent Res. 82 (12), 993-997 (2003).
- Yao, C., et al. Lipopolysaccharide-induced elevation and secretion of interleukin-1beta in the submandibular gland of male mice. Immunology. 116 (2), 213-222 (2005).
- Knudsen, J., Nauntofte, B., Josipovic, M., Engelholm, S. A., Hyldegaard, O. Effects of isoflurane anesthesia and pilocarpine on rat parotid saliva flow. Radiat Res. 176 (1), 84-88 (2011).
- Kohrs, R., Durieux, M. E. Ketamine: teaching an old drug new tricks. Anesth Analg. 87 (5), 1186-1193 (1998).
- Kozaki, T., Hashiguchi, N., Kaji, Y., Yasukouchi, A., Tochihara, Y. Effects of saliva collection using cotton swab on cortisol enzyme immunoassay. Eur J Appl Physiol. 107 (6), 743-746 (2009).
