Summary
Qui, presentiamo un protocollo per isolare e coltivare mastociti peritoneali murini. Inoltre descriviamo due protocolli per la loro caratterizzazione funzionale: un imaging fluorescente della concentrazione intracellulare di gratuito Ca2 + e un test di degranulazione basata sulla quantificazione colorimetrica della β-esosaminidasi rilasciato.
Abstract
Mastociti (MCs), come parte del sistema immunitario, gioca un ruolo chiave nella difesa ospite contro parecchi agenti patogeni e nell'inizio della risposta immunitaria allergica. L'attivazione di MCs via il cross-linking di superficie IgE associato al recettore ad alta affinità IgE (FcεRI), così come attraverso la stimolazione di parecchi altri ricevitori, avvia l'aumento del libero intracellulare Ca2 + livello ([Ca2 +]i) che promuove il rilascio di mediatori infiammatori e allergici. L'identificazione dei costituenti molecolari coinvolti in queste vie di segnalazione è fondamentale per la comprensione del regolamento della funzione di MC. In questo articolo, descriviamo un protocollo per l'isolamento di tipo murino tessuto connettivo MCs di lavaggio peritoneale e coltivazione di MCs peritoneale (PMC). Culture di MCs da vari modelli di mouse di knockout di questa metodologia rappresentano un approccio utile per l'identificazione delle proteine coinvolte nella MC vie di segnalazione. Inoltre, abbiamo anche descrivere un protocollo per singola cella Fura-2 di imaging, come un'importante tecnica per la quantificazione di Ca2 + segnalazione al MCs. fluorescenza-basata monitoraggio [Ca2 +]i è un affidabile e comunemente usato approccio alla Studio Ca2 + segnalazione eventi, inclusa l'entrata di calcio store-operati, che è della massima importanza per l'attivazione di MC. Per l'analisi di MC degranulazione, descriviamo un'analisi del rilascio β-esosaminidasi. La quantità di β-esosaminidasi rilasciato nel terreno di coltura è considerata come un indicatore di degranulazione per tutti i tre diversi sottoinsiemi secretivi descritto in MCs. β-esosaminidasi può essere facilmente quantificato dalla sua reazione con un substrato di colorigenic in un analisi colorimetrica del piastra microtiter. Questa tecnica altamente riproducibile è conveniente e non richiede nessuna apparecchiatura specializzata. Nel complesso, il protocollo fornito di seguito viene illustrato un alto rendimento di MCs che esprimono marcatori di superficie tipici di MC, visualizzazione di caratteristiche morfologiche e fenotipiche tipiche di MCs e dimostrando le risposte altamente riproducibili per secretagoghi in Ca2 +- analisi di imaging e degranulazione.
Introduction
MCs gioca un ruolo di primo piano durante la risposta immunitaria innata ed acquisita. In particolare, MCs partecipare l'uccisione degli agenti patogeni, quali batteri e parassiti e anche degradare peptidi endogeni potenzialmente tossici o componenti dei veleni (per vedere la recensione Galli et al. 20081). Il ruolo fisiologico di MCs nell'immunità innata e adattiva è oggetto di acceso dibattito. Pertanto, le numerose discrepanze di dati negli studi effettuati con diversi modelli di mouse MC-carenti richiedono una rivalutazione sistematica delle funzioni immunologiche di MCs oltre allergia2. MCs maturo sono principalmente localizzati in tessuti e organi come la pelle, del polmone e intestino e solitamente sono trovati soltanto in piccole quantità nel sangue. MCs derivano da precursori ematopoietici, come progenitori MC e completare la loro differenziazione e maturazione nei microambienti di quasi tutti i tessuti vascolarizzati1. T-cellula-derivati fattore interleuchina (IL) -3 promuove selettivamente la vitalità, la proliferazione e la differenziazione di una popolazione pluripotenti del mouse MCs da loro progenitori ematopoietici3. Fattore della cellula formativa (SCF) è prodotto dalle cellule strutturali nei tessuti e svolge un ruolo cruciale nello sviluppo, sopravvivenza, migrazione e funzione4MC. Le proprietà di singoli MCs possono differire a seconda della loro capacità di sintetizzare e memorizzare varie proteasi o proteoglicani. Nei topi, il cosiddetto tessuto connettivo-tipo MCs si distinguono dalle mucose MCs secondo la loro localizzazione anatomica, la morfologia e il contenuto di eparina e proteasi5.
Nel MCs, un aumento di libero citosolico Ca2 + ([Ca2 +]i) è indispensabile per la produzione degli eicosanoidi e degranulazione, così come per la sintesi di citochine e l'attivazione di fattori trascrizionali in risposta all'antigene e diversi secretagoghi6. Un importante obiettivo a valle di questi stimoli è fosfolipasi C, che idrolizza il fosfatidilinositolo 4,5-bisfosfato diacilglicerolo (DAG) e inositolo 1,4,5-trifosfato. DAG attiva la proteina chinasi C e IP3 rilascia ioni di Ca2 + dal reticolo endoplasmatico. Lo svuotamento di questi negozi attiva afflusso di Ca2 + attraverso la membrana plasmatica Ca2 + canali, portando a memorizzare voce calcio gestito (SOCE). Questo processo è evocato attraverso l'interazione del Ca2 +-sensore, stromal interazione molecola-1 (Stim1), nel reticolo endoplasmatico con Orai17 , nonché attraverso l'attivazione di recettori transitoria potenziali canonico (TRPC) canale proteine (per review Vedi Freichel et al. 20148) nella membrana plasmatica.
Per studiare il ruolo fisiologico di questi canali, molti farmacologici (applicazione di bloccanti dei canali) o approcci genetici sono tipicamente utilizzati. In quest'ultimo caso, soppressione dell'espressione della proteina è realizzata prendendo di mira il mRNA (atterramento) o la modifica di DNA genomico con globale o tessuto-specifici9 omissione di un esone codifica un poro che formano unità secondaria di un canale (knockout). La disponibilità di un bloccante con sufficiente specificità per questi canali è limitata. Inoltre, l'approccio atterramento richiede controllo attento della sua efficacia utilizzando, ad es., Western blot analisi ed è ostacolata dalla mancanza di anticorpi specifici per la proteina canale mirato in molti casi. Così, l'utilizzo di modelli murini knockout è ancora considerato come il gold standard per questo tipo di analisi. Un modello preferito in vitro per lo studio delle funzioni MC è la coltivazione di PMC che può essere isolato ex vivo come una popolazione completamente matura (al contrario di differenziazione MCs in vitro da, ad es., cellule del midollo osseo)10 . Rispetto al midollo osseo derivato MCs (cellule), che vengono anche comunemente utilizzati per studiare la funzione MC in vitro, la stimolazione di FcεRI e beta-esosaminidasi rilascio è aumentato 8 volte e 100 volte in PMCs, rispettivamente. In questo articolo, descriviamo un metodo di isolamento e coltura di PMCs murino, che permette di ottenere dopo 2 settimane di coltura un numero elevato di puro tessuto connettivo tipo MCs, sufficiente per un'ulteriore analisi.
Nonostante i recenti progressi nello sviluppo e applicazione di indicatori di calcio codificato geneticamente, il loro uso è ancora limitata da difficoltà nella consegna dei geni alle cellule bersaglio, in particolare, in cellule altamente specializzate quali primaria MCs coltivate. Inoltre, questo gruppo di indicatori fluorescenti per [Ca2 +]io misure manca ancora raziometrici coloranti con un'alta gamma dinamica. Per questi motivi, il metodo preferito per raziometrica [Ca2 +]ho misura è ancora l'uso del colorante fluorescente "Fura-2"11.
Attualmente, il più diffuso approccio per la valutazione dell'attivazione di MC e degranulazione è la misura dell'attività β-esosaminidasi. Β-esosaminidasi, un mediatore allergico, sono uno dei componenti del granello di MC che è co-pubblicato con istamina in proporzione costante da MCs12. Β-esosaminidasi possono essere misurata facilmente e con precisione attraverso la reazione con un substrato specifico, che produce una quantità misurabile di un prodotto colorigenic che è facilmente rilevabile in un saggio colorimetrico di micropiastre. In questo articolo, un'applicazione di questa tecnica per l'analisi del degranulation di PMC in risposta a vari stimoli è segnalata.
Aggregazione del recettore IgE plasmalemmal ad alta affinità (FcɛRI) attiva nel MCs una versatile via di segnalazione intracellulare, che conduce ad un rilascio del granello secretivo contenuto nello spazio extracellulare circostante. Oltre l'antigene specifico, molti altri stimoli possono attivare MCs per rilasciare una gamma diversificata di mediatori di immunomodulatori, come complemento anafilotossine (ad es., C3a e C5a)13, il vasocostrittore del peptide endotelina 1 (ET1)14 , così come numerose sostanze cationiche e farmaci provocando reazioni pseudoallergiche (ad es., icatibant)15 legandosi a MRGPRX216. Vie di segnalazione intracellulari coinvolti nella degranulazione MCs indotta da MRGPR sono poco caratterizzate rispetto FcɛRI-mediata segnalazione intracellulare; queste vie solo cominciato a essere studiato intensivamente durante l'ultimo pochi anni17 dopo l' identificazione del recettore16. In gran parte, i canali ionici di membrana plasmatica coinvolti nella voce calcio seguita da stimolazione MRGPRX2 rimangono per essere capito. Pertanto, il presente articolo si concentra anche su segnalazione del calcio intracellulare e degranulazione di MCs stimolate con gli agonisti MRGPR.
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Protocol
Tutte le procedure degli animali sono state effettuate secondo le direttive della normativa tedesca per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (ufficialmente approvato dal Consiglio regionale di Karlsruhe).
1. PMC isolamento e coltura di lavaggio intraperitoneale
| 1 | Ghiaccio |
| 2 | siringhe da 10 mL |
| 3 | Aghi 27 G |
| 4 | Aghi di 20 G |
| 5 | Perni e blocco di polistirolo |
| 6 | Tubi di raccolta (50 mL provette in plastica) |
| 7 | etanolo al 70% |
| 8 | Medium RPMI (Pre refrigerati e tenuta su ghiaccio) |
| 9 | PMC Medium: Medium RPMI + 20% FCS (siero fetale di vitello) + 1% soluzione di penicillina streptomicina (penna-Strep) |
| 10 | Soluzione tampone fosfato di Dulbecco - DPBS (senza Ca2 + e Mg2 +) |
| 11 | Matracci di cultura (25 cm) |
| 12 | Soluzioni di riserva di fattori di crescita (IL-3: 1 μg/μL; SCF: 2,5 μg/mL) |
| 13 | Pipette sierologiche (10 mL) |
| 14 | Punte di pipette sterili (20-200 µ l) |
| 15 | Emocitometro |
| 16 | Centrifuga di panca |
| 17 | Forbici e pinze |
| 18 | Camera di CO2 per topi |
| 19 | Cappa sterile aperto |
| 20 | Cappa sterile chiusa |
| 21 | Incubatrice di cellulare (37 ° C e 5% CO2) |
| 22 | Pipette di trasferimento (20-200 µ l) |
Tabella 1: Materiali per il passaggio 1.
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Isolamento di PMC di lavaggio intraperitoneale
- Prima l'isolamento delle cellule, preparare i materiali elencati nella tabella 1.
- Utilizzare 8 alla 14 settimana-vecchi di topo maschio per l'isolamento di PMC. Eutanasia di un mouse per inalazione di CO2 e confermare la morte di perdita dei riflessi. Spruzzare il mouse con etanolo al 70% e fissarlo su un blocco di schiuma con perni (lato dorsale verso il basso). Togliere la pelle ventrale del mouse utilizzando le forbici bordo smussato. Evitare di danneggiare la cavità peritoneale.
Nota: Abbiamo in genere utilizzano questo protocollo per topi con un background genetico del ceppo C57BL/6N. - Iniettare 7 mL di medium RPMI ghiacciato e 5 ml di aria nella cavità peritoneale, utilizzando una siringa da 10 mL con ago 27G. Spingere l'ago nel peritoneo e non perforare qualsiasi altro organo. Utilizzare un posto nella regione del grasso epididimario per ridurre il rischio di una perforazione dell'organo.
- Dopo l'iniezione, agitare il mouse per 1 min staccare le cellule peritoneali nel medium RPMI. Non agitare il mouse troppo fortemente, per evitare di danneggiare gli organi interni e la contaminazione della cavità peritoneale con il sangue.
- Riutilizzare la siringa 10 mL dotandolo di una nuova cannula 20G. Spostare gli organi interni su un lato inclinando il blocco di schiuma e picchiettando delicatamente sulla panchina per facilitare l'aspirazione medio da altro lato. Inserire un ago di 20 G, in rilievo fino e aspirare il liquido dall'addome delicatamente e lentamente (~0.5 mL/s) per evitare l'intasamento di organi interni. Raccogliere quanto più fluido possibile (in genere 5-6 mL).
- Rimuovere l'ago dalla siringa e trasferire la sospensione cellulare raccolti in una provetta di raccolta sul ghiaccio. Scartare una provetta se c'è contaminazione di sangue visibile.
- Centrifugare le provette con una sospensione cellulare a ~ 300 x g per 5 min. Sotto una cappa sterile aspirare il supernatante. Per ogni mouse, combinare i pellet di campione in 4 mL di freddo (4 – 10 ° C) Medium PMC e trasferimento la sospensione cellulare in un matraccio di cultura 25 cm2 . Aggiungere i fattori di crescita IL-3 e SCF per le concentrazioni finali 10 ng/mL e 30 ng/mL, rispettivamente. Collocare la beuta contenente le celle in un incubatore (37 ° C e 5% CO2) ed incubare per ~ 48 h fino a quando la procedura successiva.
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Cultura PMC
- Giorno 2 (~ 48 h dopo l'isolamento): cambiamento medio
- Per rimuovere il surnatante e antiaderente cellule (eritrociti e cellule morte), aspirare il mezzo dal pallone posizionando la punta di una pipetta di Pasteur al bordo del pallone e che tiene il pallone quasi orizzontalmente. Aggiungere 4 mL di Medium di PMC pre-riscaldato per topo. Aggiungere i fattori di crescita IL-3 (10 ng/mL) e SCF (30 ng/mL). Collocare la beuta contenente le celle in un incubatore (37 ° C e 5% CO2).
- Giorno 9: Cella spaccare
- Trasferire la sospensione cellulare nel matraccio di cultura delle cellule in un tubo di plastica centrifuga da 50 mL. Lavare il matraccio tre volte con soluzione tampone fosfato di 10 mL pre-riscaldati (37 ° C) Dulbecco (DPBS), raccogliendo la sospensione delle cellule con le cellule indipendenti nella stessa 50 mL in plastica tubo centrifugo. Contare la concentrazione cellulare di un emocitometro e calcolare il numero totale delle cellule.
- Centrifugare la sospensione cellulare a ~ 300 x g per 5 min e aspirare il supernatante. Recuperare il pellet in pre-riscaldato PMC Medium (37 ° C) per ottenere la cella concentrazione 1 x 106 cellule/mL. Trasferire la sospensione cellulare in un pallone di cultura di nuovo 25 cm2 . Scartare il vecchio pallone con fibroblasti aderendo alla parte inferiore.
- Aggiungere i fattori di crescita IL-3 (10 ng/mL) e SCF (30 ng/mL) e posizionare la beuta contenente le celle in un incubatore (37 ° C e 5% CO2).
- Giorni 12 – 15: misure di cella
- Se sono previsti degli esperimenti con stimolazione dei recettori FcɛRI, pretrattare le cellule durante la notte con 300 ng/mL di IgE anti-DNP nel medium di coltura standard. Procedere con il passaggio 2 o 3.
- Giorno 2 (~ 48 h dopo l'isolamento): cambiamento medio
2. misura della concentrazione di calcio libero intracellulare fluorometrica nel PMC
- Prima le misurazioni, preparare i materiali elencati nella tabella 2. Inoltre, preparare un'installazione di Imaging composto: microscopio invertito a fluorescenza; Obiettivo: 40 X / 1.3 olio; Fura 2 filtro impostato; Telecamera CCD; Sorgente di luce di eccitazione; Programma di acquisizione di immagini; Sistema di applicazione della soluzione di gravità.
| 1 | PMC (12 – 15 giorni) 1 x 106 cellule/mL |
| 2 | Concanavalina A |
| 3 | Fura-2 AM |
| 4 | Soluzione al 20% Pluronic F-127 |
| 5 | Vetrini coprioggetto occhiali rotondi; ø 25 mm; N ° 1 |
| 6 | Soluzione di riserva di DNP-HSA (albumina di siero dinitrofenolo-umani) |
| 7 | Soluzione di riserva anti-DNP-anticorpo (IgE) |
| 8 | Piastra di fondo piatto (12 pozzi) |
| 9 | Soluzione madre di composto 48/80 |
| 10 | Coprire bene Imaging Chambers |
| 11 | Emocitometro |
| 12 | Pipette di trasferimento (20-200 µ l) |
Tabella 2: Materiali per il passaggio 2.
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Preparazione imaging Fura-2
- Eseguire un conteggio delle cellule usando un emocitometro e regolare la concentrazione cellulare di 1 x 106 cellule/mL. Dividere le colonie PMCs pipettando delicatamente (3 – 5 volte) la sospensione cellulare con una pipetta da 1 mL.
- Preparare un Ca2 +-contenente HEPES soluzione salina tamponata (Ca2 +- HBSS) composto da 135 mM NaCl, 6 mM KCl, 2mm CaCl2, 1,2 mM MgCl2, 10 mM HEPES e 12 millimetri di glucosio. Regolare il pH a 7.4 con 3 M NaOH.
- Preparare la concanavalina A vetrini rivestiti di pipettaggio 1 goccia di soluzione di concanavalina A (0,1 mg/mL in H2O) su ogni 25 mm turno vetro di copertura sotto una cappa sterile. Lasciare le gocce su vetrini coprioggetto per almeno 1 min, quindi rimuovere la maggior parte della soluzione con una pipetta e lasciare asciugare all'aria il coprioggetto per 45 min. Premere delicatamente la concanavalina A trattati vetrini coprioggetto sulla gomma imaging camera (Vedi Tabella materiali) fino a quando esse attribuiscono per ottenere la formazione immagine di alloggiamenti di microscopia.
Nota: Diapositive di poli-L-lisina rivestito utilizzabile come un'alternativa. - Sciogliere il Ca2 + colorante fluorescente Fura-2 AM (1 mM) in dimetilsolfossido (DMSO). Conservare questa soluzione al riparo dalla luce.
- Diluire la Fura-2 soluzione di riserva di AM in Ca2 +- HBSS ad una concentrazione finale di 5 µM al fine di preparare il "tampone di caricamento". Completare con 5 µ l/mL di 20% pluronic F-127 in DMSO.
- Mix 500 µ l di "buffer di caricamento" con 500 µ l della sospensione delle cellule PMC. Pipettare la miscela nella camera di imaging e incubare le cellule per 20 – 30 min a temperatura ambiente al buio.
- Impostare il sistema di applicazione con diverse soluzioni secondo il protocollo di stimolazione di gravità. Supplemento siringa 1 con 40 mL di soluzione di Ca2 +- HBSS, siringa 2 con 40 mL di Ca2 +- HBSS soluzione contenente 100 ng/mL DNP, siringa 3 con 40 mL di Ca2 +- HBSS soluzione contenente 50 µ g/mL composto 48/80, siringa 4 con 40 mL di dimensioni nominali Ca2 +-gratis-soluzione HBSS e la siringa 5 con 40 mL di dimensioni nominali Ca2 +-gratis-soluzione HBSS contenente 2 µM Thapsigargin.
- Preparare un obiettivo a immersione in olio alto-apertura X 40 inserendo una piccola goccia di olio per immersione su di esso.
- Montare il sistema di applicazione sul palco del microscopio invertito. Mettere la camera imaging con le cellule caricate nel sistema di applicazione e fissarlo per evitare qualsiasi movimento durante la registrazione. Accendere la luce trasmessa e concentrare le cellule.
- Sciacquare le cellule tre volte con Ca2 +- HBSS buffer utilizzando il sistema di applicazione di gravità.
- Incubare le cellule in Ca2 +- HBSS per 5 min per Fura-2 de-esterificazione AM.
- Sciacquare le cellule ancora una volta prima di iniziare l'imaging, per rimuovere eventuali potenzialmente trapelate tintura fluorescente.
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Formazione immagine della cella
- Avviare il programma di acquisizione immagini in modalità acquisizione fisiologica. Aprire la finestra di installazione e regolare la messa a fuoco e il tempo di acquisizione ottimale (che dovrebbe essere lo stesso per l'eccitazione con 340 nm e 380 nm e in genere varia tra 50 e 150 ms).
Nota: Ridurre al minimo l'esposizione del Fura-2 cella caricata da qualsiasi luce per evitare photobleaching della tintura. - Un quadro di riferimento di immagine e contrassegnare le celle come regioni di interesse (ROI). Contrassegnare l'ultimo ROI in un'area dove le celle non sono presenti e definiscono come sfondo.
- Completare l'installazione e avviare la misurazione con una frequenza di acquisizione s 5.
Nota: Le cellule si illumina alternativamente con la luce di eccitazione di 340 nm e 380 nm e la fluorescenza emessa (> 510 nm) saranno raccolte mediante la telecamera CCD. Le immagini di fluorescenza segnali F340 nm e F380 nm come pure il rapporto (F340 nm/F380 nm) verranno visualizzate in tre finestre. I grafici del corso di tempo dell'intensità di fluorescenza ROIs individuali significano valori verranno visualizzati anche continuamente. - Aggiungere soluzioni al numero corretto ciclo secondo il disegno dell'esperimento:
- A misura dell'antigene-indotta l'elevazione del [Ca2 +]i, come illustrato nella Figura 2A, 2B, applicare la soluzione di siringa 2 dopo ciclo 20 e interrompere la registrazione dopo ciclo 150.
- Per misurare l'elevazione indotta da composto 48/80 [Ca2 +]i,come illustrato in Figura 2C, applicare la soluzione di siringa 3 dopo ciclo 20 e interrompere la registrazione dopo ciclo 150.
- Per misurare l'elevazione della [Ca2 +]ho evocato da SOCE, come illustrato nella Figura 2D, applicare la soluzione di siringa 4 dopo ciclo 10, applicare la soluzione di siringa 5 dopo ciclo 70, applicare la soluzione di siringa 4 dopo ciclo 120, applicare la soluzione di siringa 1 dopo ciclo 150 e interrompere la registrazione dopo ciclo 220.
- Dopo aver terminato la misurazione, è necessario convertire i risultati in una tabella di rapporto contenente le intensità misurate per lunghezze d'onda di eccitazione con e senza correzione del fondo, nonché i valori di rapporto con e senza correzione di fondo per ogni ROI e ogni punto del tempo di misurazione. Nel programma di acquisizione, premere i pulsanti: "inizio fresa", "Seleziona tutti", "Converti tutti", "misure di fisiologia", "Ok,"Ok". Salvare i file come tabelle e serie di immagini per l'analisi off-line.
- Avviare il programma di acquisizione immagini in modalità acquisizione fisiologica. Aprire la finestra di installazione e regolare la messa a fuoco e il tempo di acquisizione ottimale (che dovrebbe essere lo stesso per l'eccitazione con 340 nm e 380 nm e in genere varia tra 50 e 150 ms).
3. beta-esosaminidasi rilascio misura in PMC
| 1 | PMC (12 – 15 giorni) 1 x 106 cellule/mL |
| 2 | Soluzione di riserva anti-DNP-anticorpo (IgE) |
| 3 | Soluzione di riserva di DNP-HSA |
| 4 | Soluzione madre di composto 48/80 |
| 5 | Ionomicina |
| 6 | Piastra a 96 pozzetti, fondo a v |
| 7 | Piastre da 96 pozzetti, fondo piatto |
| 8 | Provette in plastica (15 mL) |
| 9 | Pipette sierologiche |
| 10 | Incubatrice di cellulare (37 ° C e 5% CO2) |
| 11 | Centrifuga di panca |
| 12 | Lettore di micropiastre per misure di densità ottica |
| 13 | Pipetta multicanale (20 – 200 μL) |
| 14 | Emocitometro |
Tabella 3: Materiali per il passaggio 3.
- Prima le misurazioni, preparare i materiali elencati nella tabella 3.
Nota: β-esosaminidasi rilasciato da MCs dopo loro stimolazione idrolizza p-nitrofenil-acetil-D-glucosamina (pNAG) p-nitrofenolo e N-acetil-D-glucosamina. La quantità di β-esosaminidasi nel campione è proporzionale alla quantità di p-nitrofenolo che si formerà. In un ambiente a pH elevato di "Soluzione", p-nitrofenolo esiste come completamente deprotonato p-nitrophenolat e può essere rilevato dalla sua luce assorbanza a 405 nm. - Preparare la soluzione di Tyrode contenente 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,4 mM CaCl2, 1mm MgCl2, 10 mM HEPES, 5,6 millimetri di glucosio e BSA 0.1%. Regolare il pH a 7.4 con 3 M NaOH.
- Preparare la soluzione di lisi aggiungendo un 1% del volume di Triton X-100 soluzione di Tyrode.
- Preparare la soluzione di stop composta da glicina di 200 mM e regolare il pH a 10,7 con NaOH.
- Preparare la soluzione di pNAG (2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside 4-nitrofenil) sciogliendo pNAG in acido citrico 0,4 M a una concentrazione finale di 4 mM.
- Calcolare la quantità di cellule necessarie per il dosaggio (eseguire il dosaggio in duplicato). Utilizzare 200.000 PMC per pozzetto. Utilizzare 2 pozzi come controlli negativi (soluzione di Tyrode senza qualsiasi secretagogues come DNP o composto 48/80) e 2 pozzi come controlli positivi (soluzione di Tyrode con 10 µM ionomicina) per ogni genotipo.
- Trasferire le cellule in una provetta da centrifuga plastica 15 mL, regolare il volume a 15 mL con soluzione di Tyrode e centrifugare a 200 x g per 4 minuti rimuovere il surnatante con una pipetta Pasteur e risospendere le cellule in soluzione di Tyrode a 2 x 106 cellule / ml.
- Trasferire 100 µ l della sospensione delle cellule per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti fondo V bene. Aggiungere 25 µ l di soluzione di controllo o di stimolazione ad ogni pozzetto (secondo lo schema di pipettaggio illustrato in Figura 3A). Incubare le cellule per 45 min a 37 ° C e 5% CO2.
- Fermare la reazione inserendo la piastra a 96 pozzetti in ghiaccio per 5 min. Poi, centrifugare la piastra a 4 ° C per 4 min a 120 x g. Trasferire 120 µ l del surnatante con una pipetta multicanale per una piastra a 96 pozzetti a fondo piatto e posizionarlo sul ghiaccio. Evitare accuratamente di toccare il pellet di cellule, ma completamente aspirare il supernatante.
- Aggiungere 125 µ l di tampone di lisi per il pellet cellulare. Incubare il pellet cellulare per 5 min a temperatura ambiente e risospendere li dopo l'incubazione pipettando ripetute (circa 5 volte).
- Pipettare 25 µ l della soluzione pNAG (4 mM) nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti a fondo piatto nuovo richiesti. Aggiungere 25 µ l da ogni surnatante per la soluzione di preparati pNAG, nonché a 25 µ l di ogni lysate delle cellule.
- Incubare i batch di reazione per 1h a 37 ° C. Dopo l'incubazione, dispensare 150 µ l di soluzione bloccante in ciascun pozzetto per arrestare la reazione.
- Analizzare la piastra con un lettore di micropiastre utilizzando un'impostazione di doppio-lunghezza d'onda 405 nm con riferimento 630 nm per la sottrazione di automatico in background. Nel programma di acquisizione, barrare la casella "Reference" e nel menu elemento del programma "Assorbanza", selezionare "630 nm" dall'elenco a discesa. Se la densità ottica dei campioni è troppo alta, preparare una diluizione appropriata della sonda prima rimisurazione.
- Calcolare la percentuale di rilascio β-esosaminidasi secondo la seguente equazione:
dove rilascio [%] è la percentuale di rilascio specifico beta-esosaminidasi, un [surnatante] è lo sfondo corretto assorbimento del surnatante ed un [lisato] è lo sfondo corretto assorbimento della cella corrispondente lisata.
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Representative Results
PMC sono stati isolati da topi wild type 3 (C57BL/6N) tramite il lavaggio intraperitoneale e ulteriormente coltivate in medium RPMI completate con FCS 20% e 1% penna-Strep in presenza di fattori di crescita (IL-3 a 10 ng/mL) e SCF a 30 ng/mL sotto sterile umidificati condizioni alle 37 ° C e 5% CO2. Il mezzo è stato modificato nei giorni 2 e 9 dopo l'isolamento delle cellule. La morfologia delle cellule è stata analizzata mediante trasmissione luce imaging DIC (Vedi Figura 1A, B). Il contrasto delle cellule e la granularità ha dimostrato buona attuabilità. Dopo 2 settimane di coltura in queste condizioni, è stata ottenuta una popolazione omogenea di 1.5 x 107 cellule. Analisi di citometria a flusso delle cellule co-macchiate con l'anticorpo anti-IgE coniugato con FITC e anticorpo Anti-c-Kit, coniugato con PE ha rivelato 98,6% di FITC positiva e 99,8% PE cellule positive (Figura 1C). 98,5% di cellule coltivate erano doppio positivo per FITC e PE (Figura 1C), che illustrano le caratteristiche tipiche del MCs maturo.
Per l'ulteriore analisi funzionale delle cellule ottenute, fluorometrica [Ca2 +]io usando l'indicatore fluorescente Fura-2 sono state effettuate. Fura-2 cellule caricate alternativamente sono state illuminate con 340 nm e 380 nm eccitazione luce ogni 5 s e fluorescenza > 510 nm è stato registrato utilizzando una telecamera CCD. Il rapporto della fluorescenza (F340/F380) è stata costantemente monitorato. Applicazione di DNP (100 ng/mL) a PMC incubate durante la notte con 300 ng/mL di IgE anti-DNP ha evocato una pronunciata elevazione del [Ca2 +]i livello, che lentamente decadde al massimo mezza per diversi minuti (Figura 2A, B). La variabilità delle risposte delle cellule era relativamente bassa (Figura 2A, B). Stimolazione dei recettori MRGPRB2 con 50 µ g/mL di composto 48/80 con lo stesso protocollo di tempo inoltre ha aumentato significativamente [Ca2 +]i nella PMCs Fura-2-caricato con una molto simile ampiezza media della risposta (Figura 2C). Per l'analisi dei SOCE nel PMC, è stato applicato un protocollo di "aggiunta": 10 cicli dopo l'inizio della misurazione, esterno Ca2 + è stato rimosso e durante cicli di 70 – 120, Thapsigargin (2 µM), un inibitore del reticolo endoplasmatico atpasi, era applicato per lo svuotamento di Ca2 + depositi intracellulari e per attivazione massimale dei SOCE. La [Ca2 +]ho altezza transitoria riflette il rilascio di Ca2 + da Ca2 + depositi intracellulari in una dimensioni nominali Ca2 +-soluzione di vasca (Figura 2D) libera. Ripristino della concentrazione di Ca2 + esterna a 2 mM dopo ciclo 150 ha provocato un aumento prominente della [Ca2 +]i livello dovuto l'afflusso di Ca2 + attraverso i canali SOCE (Figura 2D). Questa componente della Ca2 + risposta è stata fortemente inibita in presenza di 10 µM GSK 7975A, conosciuto come bloccante CRAC, considerando che il rilascio di Ca2 + dai Ca2 + depositi intracellulari è rimasto invariato (Figura 2D ).
Nel passaggio successivo, abbiamo testato la capacità del PMC isolato di subire degranulazione reticolazione dei recettori ad alta affinità FcɛRI o stimolazione dei recettori MRGPRB2. Per questo scopo, è stato effettuato un test di rilascio di ß-esosaminidasi. Le cellule sono stati aggiunti ad una piastra di fondo V 96 pozzetti (2 x 105 cellule/pozzetto) e stimolate secondo lo schema illustrato in Figura 3A per 45 min a 37 ° C. La piastra è stata centrifugata e dopo la rimozione del surnatante, il pellet sono state lisate. Il contenuto di beta-esosaminidasi dei surnatanti individuali e lisati di pellet è stato analizzato dalle loro reazioni con pNAG durante l'incubazione 1h a 37 ° C. La quantità dei prodotti di reazione è stata rilevata colorimetricamente ed è stata calcolata la percentuale della ß-esosaminidasi rilasciato (Vedi Figura 3B). Il rilascio spontaneo era molto basso (1%), mentre le risposte agli stimoli di degranulazione forte come 10 µM ionomicina e composto 48/80 a 50 µ g/mL sono stati oltre 40% e 60%, rispettivamente. Degranulazione risposte alla stimolazione di DNP erano dose-dipendente sopra la gamma di concentrazione di 10 – 300 ng/mL. Insieme, questi dati indicano chiaramente un buono stato funzionale del PMC isolato.
Figura 1 : Caratterizzazione delle primarie coltivate murini wild-type PMCs eseguita utilizzando analisi di citometria a flusso e microscopia DIC. (A, B) Immagini rappresentative ottenute utilizzando 20 X plasDIC obiettivo di PMCs coltivate in fiasche di 25cm2 plastica 1 h dopo l'isolamento delle cellule tramite il lavaggio intraperitoneale (A) e il giorno 9 della coltura (B). Barre della scala nel giusto angolo inferiore indicano 100 µm. (C) flusso cytometry analisi di PMC (12 giorni coltivati secondo il protocollo descritto sopra) Co-macchiato con anti-IgE anticorpo coniugato con fluoresceina isotiocianato (FITC) e Anti-c-kit anticorpo coniugato con ficoeritrina (PE). La trama di densità cellulare è diviso in quattro quadranti: Q1, PE sopra autofluorescence livello/FITC sotto il livello di autofluorescenza; Q2, PE sopra autofluorescence livello/FITC sopra il livello di autofluorescenza; Q3, PE sotto livello di autofluorescenza/FITC sotto il livello di autofluorescenza; Q4, PE sotto livello di autofluorescenza/FITC sopra il livello di autofluorescenza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Registrazione di [Ca2 +] ho Fura-2 caricato PMCs isolate da topi wild type. [Ca 2 + ]ho presentato come rapporto di F340/F380 fluorescenza. (A) tracce rappresentative del [Ca2 +]ho tempo corso di singoli PMCs (n = 38) stimolate con DNP (100 ng/mL). (B) corso di tempo di DNP (100 ng/mL)-evocato [Ca2 +]io elevazione. Ogni punto di dati indica i valori medi ottenuti da 38 singole celle illustrate in pannello A. Il PMC sono stati pretrattati durante la notte con 300 ng/mL di IgE anti-DNP. (C) corso di tempo dei valori medi di composto 48/80-induced [Ca2 +]io elevazione in PMCs (n = 60). (D) corso di tempo dei valori medi di [Ca2 +]i cambiamenti durante intracellulare di Ca2 +-memorizzare lo svuotamento indotto dall'applicazione di 2 µM Thapsigargin (Tg) in dimensioni nominali Ca2 +-libera soluzione, seguita da negozio operati di afflusso del calcio dopo ri-aggiunta di 2 mM Ca2 + in soluzione del bagno nel gruppo di controllo (n = 44) di PMC (quadrati neri) e in presenza di 10 µM di GSK 7975A nella soluzione del bagno (quadrati blu) (n = 41). In B, C e D, le barre di errore indicano l'errore standard della media. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Beta-esosaminidasi rilasciare colorimetriche multi pozzetto misure effettuate con PMCs isolate da topi wild type. (A) schema di stimolazione della piastra a 96 pozzetti pipettaggio per eseguire il dosaggio di beta-esosaminidasi; i risultati sono presentati nel pannello che b. "Spontan" corrisponde al pipettaggio di soluzione di Tyrode senza l'aggiunta di qualsiasi secretagoghi; IM = ionomicina; CP 48/80 = composto 48/80. (B) Bar grafico illustrante percentuale di ß-esosaminidasi rilascio in condizioni basali (Spont), dopo stimolazione con ionomicina (IM), albumina di siero umani dinitrofenolo (DNP) e composto 48/80 (Cp 48/80) con concentrazioni indicate. L'analisi è stata eseguita in duplice copia; barre di errore indicano l'errore standard della media. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Modelli di MC possono essere utilizzati con successo per lo studio MC degranulazione, chemiotassi, adesione, come pure di delucidare le vie di trasduzione del segnale intracellulare coinvolte nell'attivazione di MC. Alcuni ricercatori uso umano MCs modelli, ad esempio linee immortalizzate (LAD2 e HMC1) o MCs umano derivati dal cordone sanguigno cellule progenitrici (cellule CD133 +) e cellule progenitrici del sangue periferico (CD34 +). Altri preferiscono roditore modelli MC, come immortalati (leucemia basophilic ratto linea MC RBL - 2H3) o in coltura primaria (mouse osso-zucchino-derivate MCs sono, PMCs) modelli. Murino MCs primario può essere utilizzato per analizzare la funzione di MC in numerosi modelli di topo "knock-out", che costituiscono l'approccio di parità aurea per l'esplorazione delle funzioni fisiologiche di particolari geni e proteine codificate. Il deficit di strumenti farmacologici per la sufficiente selettività e potenza rende questo metodo particolarmente prezioso per lo studio dei meccanismi di trasduzione del segnale da MC attivazione18. PMCs murino sono del fenotipo del tessuto connettivo che presenta una morfologia matura e alta granularità. Essi non solo rispondono bene alla reticolazione di antigene di FcεRI come sono, ma sono anche attivati da agonisti dei recettori diversi ulteriori quali endotelina 1 o 48 composto. Tuttavia, la resa della PMC in genere è notevolmente inferiore rispetto a quello delle cellule e di solito non è sufficiente per eseguire un Western blot o un'altra tecnica che richiede un gran numero di cellule. Diverse tecniche sono state descritte per l'isolamento e la purificazione di PMC. Ad esempio, centrifugazione in gradiente di Percoll è stato segnalato per produrre un'elevata purezza del cellule19; Tuttavia, il numero di cellule ottenute con questa tecnica è in genere relativamente basso. Nel protocollo descritto qui, il punto più critico è l'aspirazione della sospensione delle cellule dalla cavità peritoneale. Evitando la contaminazione del sangue del campione e aspirare la quantità massima di media possibile sono essenziali per ottenere un numero elevato di PMC di elevata purezza. Con alcuni ceppi di topi, un numero massimo di PMC è ottenuto solo da un ridotto (11-12 giorni) periodo di coltura. Lasciando queste cellule in condizioni di coltura per un tempo più lungo porta solo ad una riduzione del numero delle cellule.
Nello studio presente, descriviamo un semplice protocollo adatto per l'isolamento di MCs maturo che permette di ottenere una popolazione altamente pura di MC dalla cavità peritoneale del mouse. Le cellule ottenute sono caratterizzate da un'elevata omogeneità e presentano caratteristiche tipiche di MC, come l'espressione di marker specifici recettori (KIT e FcεRI). Queste cellule mostrano chiaramente la caratteristica di MC per degranulate e aumentare la loro [Ca2 +]io in risposta all'attivazione di FcɛRI e MRGPR.
MC è strettamente legata al livello dii [Ca2 +] determinato dal rilascio di Ca2 + dai depositi intracellulari e ingresso di Ca2 + attraverso i canali della membrana plasmatica di segnalazione. [Ca2 +] ho elevazione attiva un complesso di vie di segnalazione intracellulare che il degranulation grilletto MC. Come in altre cellule non eccitabili, la principale Ca2 + afflusso di via nel MCs è SOCE attivato dallo svuotamento del Ca2 +-negozi. Identificazione dei canali coinvolti in questa via di segnalazione è fondamentale per la comprensione della regolazione della funzione di MC. Per l'identificazione dei costituenti molecolari del pathway SOCE, la tecnica di microfluorometric che utilizza indicatori fluorescenti per Ca2 + e l'approccio elettrofisiologico "patch-clamp" hanno svolto un ruolo prominente. Tuttavia, elevazione del [Ca2 +]i livello è la somma di rilascio di Ca2 + e SOCE. Per distinguere queste due fasi di mobilizzazione di Ca2 + , il cosiddetto protocollo "Ca2 + aggiunta" (per vedere la recensione uccello et al. 200820) è stato sviluppato in precedenza. In questo protocollo, la soluzione salina esterna è passata da uno contenente normale [Ca2 +]o (1 – 2 mM) per una dimensioni nominali Ca2 +-soluzione gratuita. In queste condizioni le cellule sono trattate con thapsigargin svuotare Ca2 + negozi e quindi attivare completamente SOCE. In assenza di extracellulare Ca2 +, trattamento thapsigargin evoca la [Ca2 +]ho altezza transitoria, riflettendo un rilascio di Ca2 + ioni da Ca2 + depositi intracellulari. Tale aggiunta di Ca extracellulare2 + porta ad un aumento della [Ca2 +]i che rappresenta le SOCE. In questo articolo, presentiamo l'utilizzazione di successo di questo approccio per la caratterizzazione dei SOCE nel MCs. Per monitorare la [Ca2 +]i cambiamenti, Fura-2 è stato utilizzato come un indicatore di calcio. Nella sua forma acetossimetil, Fura-2 può essere caricato facilmente in PMC. L'utilizzo di questa tintura raziometrici permette il confronto delle ampiezze non solo della [Ca2 +]i prospetti, ma anche le differenze in [Ca2 +]i livelli basali, che è particolarmente importante per l'analisi di tipo selvaggio/knockout cellule. Confrontato con le tinture fluorescenti geneticamente codificate, uno dei principali svantaggi del Fura-2 è suo elevato accumulo nei diversi organelli cellulari e quindi contaminazione della fluorescenza citoplasmatica.
L'imaging di Fura-2 richiede una tecnica di doppia eccitazione. In genere, è tecnicamente molto più facile da utilizzare rispetto alla tecnica di doppia emissione che richiede non solo l'utilizzo di una sorgente luminosa innescata, ma inoltre il coinvolgimento di una ruota portafiltri o uno splitter di immagine nel percorso della luce di emissione. Il protocollo descritto può essere usato per Ca2 + formazione immagine di altre cellule non eccitabili.
Una caratteristica fondamentale del MCs è loro alto contenuto di granuli secretori elettrone-densi, che sono pieni di grandi quantità di mediatori e sostanze immunomodulatorie. Attivazione di MC conduce ad un rapido rilascio di granuli preformati composti. Diversi approcci per analizzare MC degranulazione in vitro sono disponibili, tra cui il rilevamento di radioattivo serotonina, istamina rilevamento utilizzando anticorpi (ELISA) e il rilevamento di un aumento dell'utilizzo di superficie della membrana plasmatica misure di capacità cellula elettrofisiologici "patch-clamp". Nella carta attuale, descriviamo un'applicazione pratica del test utilizzando multi-pozzetto rilevazione colorimetrica di in vitro rilasciato β-esosaminidasi. Questa analisi è basata sulla capacità di β-esosaminidasi per idrolizzare morsetto N-acetil-D-l'esosamina residui in N-acetil-β-D-hexosaminides21. Β-esosaminidasi sono co-pubblicato con istamina, ma anche con altri mediatori quali catepsina D o TNF e pertanto possono essere utilizzato come componente per degranulazione da più tipi di vescicole secretorie in MCs12,22.
Nella tecnica descritta, PMC sono stati stimolati a 37 ° C con diversi secretagoghi, seguite da una stima dei surnatanti così come pellet di β-esosaminidasi contenuto dalle loro reazioni con β-esosaminidasi substrato. Come il substrato, 4-nitrofenil N-acetil-β-D-glucosamminide è stato usato. Esso è stato idrolizzato di N-acetil-D-glucosamina e p- nitrofenolo. La quantità di p- nitrofenolo colorimetricamente è stata quantificata tramite l'assorbanza della luce a 405 nm. In alcune modifiche del dosaggio di rilascio beta-esosaminidasi, 4-methylumbelliferil-N-acetil -beta- glucosamina viene utilizzata come substrato. Dopo idrolisi enzimatica, la sostanza genera un composto fluorometrically rilevabile. Abbiamo espresso nella misura del degranulation come una percentuale del rilascio, normalizzato al contenuto totale. Questo ci ha permesso di evitare la variabilità introdotta da diversi numeri di cellulare e il loro contenuto granulare tra varie preparazioni di cellule. Non sottraiamo un rilascio spontaneo (osservato in assenza di MCs secretagoghi) da degranulazione stimolato netto, poiché un rilascio spontaneo è stato segnalato separatamente a causa della sua importanza come un indicatore della redditività di MC. Per evitare l'alta variabilità nei risultati del test, è importante separare con molta attenzione il sovranatante e pellet dopo la centrifugazione delle cellule stimolate. È anche essenziale per evitare la formazione di eventuali bolle nelle piastre multi-pozzetto prima di eseguire le misurazioni colorimetriche. Una limitazione significativa del metodo descritto è che il risultato è rappresentato non come valore assoluto, ma come una percentuale del Mediatore rilasciato.
Contrariamente ai metodi di rilevazione diretta di serotonina rilasciata o istamina, il dosaggio segnalato è molto più economico e non richiede nessuna apparecchiatura specializzata. Inoltre, la tecnica descritta è altamente riproducibile, non ha bisogno di essere eseguita in un laboratorio radioattivo e non richiede l'acquisto di costosi anticorpi. Di conseguenza, potrebbe essere un'ottima alternativa alle tecniche più difficili e costose.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desidera ringraziare Julia Geminn per assistenza tecnica in preparazione delle cellule di albero e coltura. Questo lavoro è stato supportato da The transregionali Collaborative Research Centre (TR-SFB) 152.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI Medium | Thermo Scientific | 21875034 | |
| DPBS | Sigma-Aldrich | 14190144 | |
| FCS | Thermo Scientific | R92157 | |
| IL-3 | R&D Systems | 403-ML | |
| SCF | Thermo Scientific | PMC2115 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | C2272 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fischer Scientific | F1221 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| DNP-HSA | Sigma-Aldrich | A6661 | |
| Anti-DNP-Antibody | Sigma-Aldrich | D-8406 | |
| Penstrep | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Compound 48/80 | Sigma-Aldrich | C2313 | |
| 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | X100 | |
| 4-Nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside | Sigma-Aldrich | N9376 | |
| CoverWell Imaging Chamber | Sigma-Aldrich | GBL635051 | |
| 96-Well plate, v-shaped bottom | Corning | 3896 | |
| 96-Well plates, flat bottom | Greiner Bio-One | 655180 | |
| Microtiter plate reader with "i-control" software | Tecan | Nano Quant, infinite M200 Pro | |
| Flat bottom plate | Greiner Bio-One | 655180 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I9657 | |
| 50 mL Plastic Centrifuge Tubes | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Culture Flasks (25 cm) | Greiner Bio-One | 69160 | |
| Cover slips glasses round; ø 25 mm; No. 1 | Menzel | CB00250RA1 | |
| Hemocytometer | VWR | 631-0696 | |
| Inverted Microscope | Zeiss | Observer Z1 | |
| Objectiv Fluar 40x/1.3 Oil | Zeiss | 440260-9900 | |
| HC Filter Set Fura 2 | AHF | H76-521 | |
| CCD Camera | Zeiss | AxioCam MRm | |
| Monochromatic Light Source | Sutter Instruments | Lambda DG-4 | |
| Imaging Acquisition Program | Zeiss | AxioVision 4.8.2 | |
| Gravity fed solution application system | Custom Made | 4-channel | |
| 15 mL Plastic Centrifuge Tubes | Sarstedt | 62,554,502 | |
| Bench Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.0R |
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