En simpel metode til dyrkning af sojabønner Protoplasts og ansøgning til forbigående gen Expression analyser
Summary
Vi udviklet en enkel og effektiv protokol for forberedelse af store mængder af sojabønner protoplasts at studere komplekse regulerende og signalering mekanismer i levende celler.
Abstract
Sojabønner (Glycine max (L.) Merr.) er en vigtig afgrøde arter og er blevet en bælgplante model for studier af genetiske og biokemiske veje. Det er derfor vigtigt at etablere en effektiv forbigående gen expression system i sojabønner. Vi rapporterer her, en enkel protokol for forberedelse af sojabønner protoplasts og dens anvendelse for forbigående funktionelle analyser. Vi fandt, at unge unifoliate blade fra sojabønner frøplanter resulterede i store mængder af høj kvalitet protoplasts. Ved at optimere en PIND-calcium-medieret transformation metode, opnåede vi høj transformation effektivitet ved hjælp af sojabønner unifoliate protoplasts. Dette system giver en effektiv og alsidig model til undersøgelse af komplekse regulerende og signalering mekanismer i live sojabønner celler og kan hjælpe til bedre forstå forskellige cellulære, udviklingsmæssige og fysiologiske processer i bælgplanter.
Introduction
Protoplasts er planteceller, der har cellevægge fjernet. Som de fleste af funktioner og aktiviteter af planteceller påstår de, protoplasts er en god modelsystem til at observere og vurdere forskellige cellulære begivenheder, og er værdifulde værktøjer til at studere somatiske hybridisering1 og plante regenerering2. Protoplasts har udnyttet også bredt for anlægget transformation3,4,5, da cellevægge ville ellers blokere passage af DNA i cellen. Protoplasts besidder nogle af de fysiologiske reaktioner og cellulære processer af intakt planter, derfor tilbyder grundlæggende værdi i grundlæggende forskning til at studere subcellulært protein lokalisering6,7,8, protein-protein interaktioner9,10, og promotor aktivitet11,12,13 i levende celler.
Isolering af planten protoplasts blev først rapporteret i 196014 og protokoller for både isoleret og transformation af protoplasts er blevet udviklet og optimeret. En standard procedure protoplast isolation indebærer opskæring af blade og Enzymatisk nedbrydning af cellevægge, efterfulgt af adskillelse af frigivne protoplasts fra ikke-fordøjet væv debris. Transformation strategier omfatter elektroporation15,16, mikroinjektion17,18, og funderede polyethylenglycol (PEG)4,5,19 metoder. En bred vifte af arter, der er blevet rapporteret succes for protoplast isolation, herunder Citrus20, Brassica21, Solanaceae22 og andre prydplante familier23,24. Mens forskellige vævstyper bruges i forskellige arter, har et system af forbigående udtryk i Arabidopsis mesofyllet protoplast (TEAMP) isoleret fra bladene af model planten Arabidopsis thaliana været veletablerede25 og bredt vedtaget til forskellige applikationer.
Sojabønner (Glycine max (L.) Merr.) er en af de vigtigste protein og olie afgrøder26. I modsætning til Arabidopsis og ris, er opnåelse af transgene sojabønner planter kendt for at være temmelig vanskeligt og lav effektivitet. Agrobacterium tumefaciens-medieret infiltration har været populært anvendes for forbigående gen expression undersøgelser i den epidermale celler i tobak27 og stiklinger i Arabidopsis28,29, hvorimod Agrobacterium rhizogenes har været brugt til transformering af behårede rødder i sojabønner30. Virus-induceret gene silencing tilgange har været udnyttet til downregulation af target gener31,32 og forbigående udtryk33 på en systemisk måde. Protoplasts giver en værdifuld og alsidig alternativ til disse tilgange. Protoplasts kan opnås fra sojas overjordiske materialer og giver mulighed for hurtig og synkroniseret transgen udtryk. Siden den oprindelige vellykkede isolering af sojabønner protoplasts i 198334, har der dog været begrænset rapporter om anvendelsen af protoplasts i sojabønner35,36,37, 38, primært som følge af forholdsvis lave udbytter af sojabønner protoplasts.
Her, beskriver vi en enkel og effektiv protokol for dyrkning af sojabønner protoplasts og dens anvendelse for forbigående gen expression undersøgelser. Ved hjælp af unge unifoliate blade fra sojabønner kimplanter, har vi kunnet opnå store mængder af afgørende protoplasts inden for et par timer. Derudover har vi optimeret en PIND-calcium-medieret transformation metode, der er enkel og billig at levere DNA i soja protoplasts med høj effektivitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol til isolering af sojabønner protoplasts og programmet til forbigående udtryk undersøgelser er blevet grundigt testet og virker meget godt i vores laboratorium. Procedurerne, der er enkel og let og kræver almindelige udstyr og minimale omkostninger. Vores protokol giver store mængder af ensartet, høj kvalitet protoplasts i forhold til tidligere rapporteret metoder34,35,36,37…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af plante Genome Research Program fra National Science Foundation (NSF-PGRP-IOS-1339388).
Materials
| MES | Sigma Aldrich | M8250-100G | |
| Cellulase CELF | Worthington Biological Corporation | LS002611 | |
| Pectolyase Y-23 | BioWorld | 9033-35-6 | |
| CELLULASE "ONOZUKA" R-10 | yakult | 10g | |
| MACEROZYME R-10 | yakult | 10g | |
| Mannitol | ICN Biomedicals | 152540 | |
| CaCl2 | Fisher | C79-500g | |
| BSA | NEB | R3535S | |
| DTT | Sigma Aldrich | D5545-5G | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653-1kg | |
| KCl | Fisher | P217-500g | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266-100g | |
| PEG4000 | Fluka | 81240 | |
| nylon mesh | carolina | 652222N | |
| Tissue Culture Plates | USA Scientific | CC7682-7506 | |
| Razor Blades | Fisher | 12-640 | |
| hemacytometer | hausserscientific | 1483 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| EZNA plasmid miniprep kit | Omega | D6942-01 | |
| GeneJET Plasmid Miniprep Kit | Thermo Scientific | K0502 | |
| Centrifuge 5810 | eppendorf | 5811000827 | |
| Centrifuge 5424 | eppendorf | 22620401 | |
| Jencons Powerpette Plus Pipet Controller | Jencons | 14526-202 | |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss | N/A | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12450 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | Denville | C1018-P | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Denville | C1060-P | |
| Newborn Calf Serum | Thermo Scientific | 16010159 | |
| Soil | Ingram's Nursery | ||
| perlite | Vigoro | 100521091 | |
| Torpedo Sand | JKS Ventures | ||
| LB Broth, Lennox (Powder) | Fisher | BP1427-500 |
References
- Melchers, G., Labib, G. Somatic hybridisation of plants by fusion of protoplasts. Mol. Gen. Genet. 135 (4), 277-294 (1974).
- Gresshoff, P. M. In vitro culture of white clover: callus, suspension, protoplast culture, and plant regeneration. Bot. Gaz. 141 (2), 157-164 (1980).
- Lörz, H., Baker, B., Schell, J. Gene transfer to cereal cells mediated by protoplast transformation. Mol. Gen. Genet. 199 (2), 178-182 (1985).
- Hayashimoto, A., Li, Z., Murai, N. A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants. Plant Physiol. 93 (3), 857-863 (1990).
- Koop, H. -. U., et al. Integration of foreign sequences into the tobacco plastome via polyethylene glycol-mediated protoplast transformation. Planta. 199 (2), 193-201 (1996).
- Hrazdina, G., Wagner, G. J., Siegelman, H. W. Subcellular localization of enzymes of anthocyanin biosynthesis in protoplasts. Phytochemistry. 17 (1), 53-56 (1978).
- Lin, W., Wittenbach, V. A. Subcellular localization of proteases in wheat and corn mesophyll protoplasts. Plant Physiol. 67 (5), 969-972 (1981).
- Vögeli-Lange, R., Wagner, G. J. Subcellular localization of cadmium and cadmium-binding peptides in tobacco leaves. Plant Physiol. 92 (4), 1086-1093 (1990).
- Chen, S., et al. A highly efficient transient protoplast system for analyzing defence gene expression and protein-protein interactions in rice. Mol. Plant Pathol. 7 (5), 417-427 (2006).
- Wu, F. -. H., et al. Tape-Arabidopsis Sandwich-a simpler Arabidopsis protoplast isolation method. Plant methods. 5 (1), 16 (2009).
- Christensen, A. H., Sharrock, R. A., Quail, P. H. Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation. Plant Mol. Biol. 18 (4), 675-689 (1992).
- Marcotte, W. R., Bayley, C. C., Quatrano, R. S. Regulation of a wheat promoter by abscisic acid in rice protoplasts. Nature. 335 (6189), 454-457 (1988).
- Dron, M., Clouse, S. D., Dixon, R. A., Lawton, M. A., Lamb, C. J. Glutathione and fungal elicitor regulation of a plant defense gene promoter in electroporated protoplasts. P. Natl. A. Sci. USA. 85 (18), 6738-6742 (1988).
- Cocking, E. A method for the isolation of plant protoplasts and vacuoles. Nature. 187 (4741), 962-963 (1960).
- Zhang, H., et al. Transgenic rice plants produced by electroporation-mediated plasmid uptake into protoplasts. Plant Cell Rep. 7 (6), 379-384 (1988).
- Fromm, M., Taylor, L. P., Walbot, V. Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation. P. Natl. A. Sci. USA. 82 (17), 5824-5828 (1985).
- Crossway, A., et al. Integration of foreign DNA following microinjection of tobacco mesophyll protoplasts. Mol. Gen. Genet. 202 (2), 179-185 (1986).
- Holm, P. B., Olsen, O., Schnorf, M., Brinch-Pedersen, H., Knudsen, S. Transformation of barley by microinjection into isolated zygote protoplasts. Transgenic Res. 9 (1), 21-32 (2000).
- Schapire, A. L., Lois, L. M. A simplified and rapid method for the isolation and transfection of Arabidopsis leaf mesophyll protoplasts for large-scale applications. Plant Signal Transduction: Methods and Protocols. 1363, 79-88 (2016).
- Niedz, R. P. Regeneration of somatic embryos from sweet orange (C. sinensis) protoplasts using semi-permeable membranes. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 84 (3), 353-357 (2006).
- Sheng, X., et al. Protoplast isolation and plant regeneration of different doubled haploid lines of cauliflower (Brassica oleracea var. botrytis). Plant Cell Tiss. Org. 107 (3), 513-520 (2011).
- Grun, P., Chu, L. -. J. Development of plants from protoplasts of Solanum (Solanaceae). Am. J. Bot. 65 (5), 538-543 (1978).
- Davey, M. R., Anthony, P., Power, J. B., Lowe, K. C. Plant protoplasts: status and biotechnological perspectives. Biotechnol. Adv. 23 (2), 131-171 (2005).
- Pitzschke, A., Persak, H. Poinsettia protoplasts-a simple, robust and efficient system for transient gene expression studies. Plant methods. 8 (1), 14 (2012).
- Yoo, S. -. D., Cho, Y. -. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat. Protoc. 2 (7), 1565 (2007).
- Sedivy, E. J., Wu, F., Hanzawa, Y. Soybean domestication: the origin, genetic architecture and molecular bases. New Phytol. 214 (2), 539-553 (2017).
- Yang, Y., Li, R., Qi, M. In vivo analysis of plant promoters and transcription factors by agroinfiltration of tobacco leaves. Plant J. 22 (6), 543-551 (2000).
- Marion, J., et al. Systematic analysis of protein subcellular localization and interaction using high-throughput transient transformation of Arabidopsis seedlings. Plant J. 56 (1), 169-179 (2008).
- Wu, H. -. Y., et al. AGROBEST: an efficient Agrobacterium-mediated transient expression method for versatile gene function analyses in Arabidopsis seedlings. Plant methods. 10 (1), 19 (2014).
- Govindarajulu, M., Elmore, J. M., Fester, T., Taylor, C. G. Evaluation of constitutive viral promoters in transgenic soybean roots and nodules. Mol Plant Pathol. 21 (8), 1027-1035 (2008).
- Nagamatsu, A., et al. Functional analysis of soybean genes involved in flavonoid biosynthesis by virus-induced gene silencing. Plant Biotechnol. J. 5 (6), 778-790 (2007).
- Juvale, P. S., et al. Temporal and spatial Bean pod mottle virus-induced gene silencing in soybean. Mol. Plant Pathol. 13 (9), 1140-1148 (2012).
- Zhang, C., Bradshaw, J. D., Whitham, S. A., Hill, J. H. The development of an efficient multipurpose bean pod mottle virus viral vector set for foreign gene expression and RNA silencing. Plant Physiol. 153 (1), 52-65 (2010).
- Lin, W. Isolation of mesophyll protoplasts from mature leaves of soybeans. Plant Physiol. 73 (4), 1067-1069 (1983).
- Yi, J., et al. A single-repeat MYB transcription factor, GmMYB176, regulates CHS8 gene expression and affects isoflavonoid biosynthesis in soybean. Plant J. 62 (6), 1019-1034 (2010).
- Faria, J. A., et al. The NAC domain-containing protein, GmNAC6, is a downstream component of the ER stress-and osmotic stress-induced NRP-mediated cell-death signaling pathway. BMC Plant Biol. 11 (1), 129 (2011).
- Kidokoro, S., et al. Soybean DREB1/CBF-type transcription factors function in heat and drought as well as cold stress-responsive gene expression. Plant J. 81 (3), 505-518 (2015).
- Sun, X., et al. Targeted mutagenesis in soybean using the CRISPR-Cas9 system. Sci Rep-UK. 5, 10342 (2015).
- Karimi, M., Inzé, D., Depicker, A. GATEWAY™ vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends Plant Sci. 7 (5), 193-195 (2002).
- Xia, Z., et al. Positional cloning and characterization reveal the molecular basis for soybean maturity locus E1 that regulates photoperiodic flowering. P. Natl. A. Sci. USA. 109 (32), E2155-E2164 (2012).
