Een eenvoudige methode voor het isoleren van soja protoplasten en toepassing op voorbijgaande gen expressie Analyses
Summary
We ontwikkelden een eenvoudige en efficiënte protocol voor de voorbereiding van grote hoeveelheden soja protoplasten om te studeren van de ingewikkelde regelgeving en signalering mechanismen in levende cellen.
Abstract
Sojabonen (Glycine max (L.) Merr.) is een belangrijk gewas soorten en geworden een peulvrucht model voor de studies van genetische en biochemische trajecten. Daarom is het belangrijk om een efficiënte voorbijgaande gen expressie systeem in soja. Wij rapporteren hier een eenvoudig protocol voor de bereiding van soja protoplasten en de toepassing ervan voor voorbijgaande functionele analyses. We vonden dat de jonge unifoliate bladeren van soja zaailingen in grote hoeveelheden hoogwaardige protoplasten resulteerde. We bereikt door het optimaliseren van een PEG-calcium-gemedieerde transformatie methode, hoge transformatie efficiëntie met behulp van soja unifoliate protoplasten. Dit systeem biedt een efficiënte en veelzijdige model voor onderzoek van complexe regelgeving en signalering mechanismen in levende soja cellen en kan helpen om beter begrijpen divers cellulaire-, ontwikkelings- en fysiologische processen van peulvruchten.
Introduction
Protoplasten zijn plantaardige cellen waarin celwanden verwijderd. Als ze beweert dat de meeste functies en activiteiten van plantencellen, protoplasten zijn een goed modelsysteem te observeren en evalueren van de verschillende cellulaire gebeurtenissen, en waardevolle hulpmiddelen te bestuderen van somatische hybridisatie1 en regeneratie2plant. Protoplasten hebben ook op grote schaal gebruikt voor plant transformatie3,4,5, aangezien celwanden zou anders het blokkeren van de passage van DNA in de cel. Protoplasten bezitten sommige van de fysiologische reacties en cellulaire processen van intact planten, vandaar het aanbieden van fundamentele waarde bij het basisonderzoek aan studie eiwit subcellular localisatie6,7,8, eiwit-eiwit interacties9,10, en promotor activiteit11,12,13 in levende cellen.
Het isolement van de plant protoplasten werd voor het eerst gemeld in 196014 en de protocollen voor zowel de isolatie en de transformatie van protoplasten zijn ontwikkeld en geoptimaliseerd. Een standaardprocedure voor isolatie van de protoplast impliceert het uitsnijden van bladeren en enzymatische vertering van celwanden, gevolgd door een scheiding van vrijgegeven protoplasten van niet-verteerde weefsels puin. Transformatie strategieën bevat electroporation15,16, microinjection17,18, en op basis van polyethyleenglycol (PEG)4,5,19 methoden. Een breed scala van soorten hebben gemeld succes voor isolatie van de protoplast, met inbegrip van Citrus20, Brassica21, Solanaceae22 en andere sierplanten gezinnen23,24. Terwijl verschillende weefseltypes (HLA) worden gebruikt in verschillende soorten, is een stelsel van meningsuiting van de voorbijgaande in Arabidopsis mesophyl protoplast (TEAMP) van de bladeren van de plant model Arabidopsis thaliana geïsoleerd goed ingeburgerd25 en algemeen aangenomen voor uiteenlopende toepassingen.
Sojabonen (Glycine max (L.) Merr.) is een van de belangrijkste eiwit en olie gewassen26. In tegenstelling tot Arabidopsis en rijst, is verkrijgen van transgene soja planten bekend nogal moeilijk en lage efficiëntie. Agrobacterium tumefaciens-gemedieerde infiltratie is volksmond gebruikt voor tijdelijke gen expressie studies in de epidermale cellen in tabak27 en zaailingen in Arabidopsis28,29, overwegende dat Agrobacterium rhizogenes is gebruikt voor transformatie van harige wortels in soja30. Virus-geïnduceerde gene silencing benaderingen hebben gebruikt voor Downregulatie van doel genen31,32 en voorbijgaande expressie33 met systemische. Protoplasten vormen een waardevolle en veelzijdig alternatief voor deze benaderingen. Protoplasten kunnen worden verkregen uit sojabonen van bovengrondse materialen en laat snel en gesynchroniseerde transgenic expressie. Echter sinds de eerste succesvolle isolatie van soja protoplasten in de 198334, zijn er beperkt verslagen over de toepassing van protoplasten in soja35,36,,37,, 38, voornamelijk te wijten aan de relatief lage opbrengst voor sojabonen protoplasten.
Hier beschrijven we een eenvoudig en efficiënt protocol voor isolatie van soja protoplasten en de toepassing ervan voor voorbijgaande gen expressie studies. Met behulp van jonge unifoliate bladeren van soja zaailingen, konden we krijgen van grote hoeveelheden van vitale protoplasten binnen een paar uur. Daarnaast hebben we een PEG-calcium-gemedieerde transformatie methode die is eenvoudig en low-cost te leveren van DNA in soja protoplasten met hoog rendement geoptimaliseerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol voor de isolatie van soja protoplasten en de toepassing op voorbijgaande expressie studies grondig is getest en werkt zeer goed in ons laboratorium. De procedures zijn eenvoudig en gemakkelijk en vereisen gewone apparatuur en minimale kosten. Ons protocol levert grote hoeveelheden van uniforme, hoge kwaliteit protoplasten in vergelijking met de eerder gemelde methoden34,35,,36,,37<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de Plant Genome Research Program van de National Science Foundation (NSF-PGRP-IOS-1339388).
Materials
| MES | Sigma Aldrich | M8250-100G | |
| Cellulase CELF | Worthington Biological Corporation | LS002611 | |
| Pectolyase Y-23 | BioWorld | 9033-35-6 | |
| CELLULASE "ONOZUKA" R-10 | yakult | 10g | |
| MACEROZYME R-10 | yakult | 10g | |
| Mannitol | ICN Biomedicals | 152540 | |
| CaCl2 | Fisher | C79-500g | |
| BSA | NEB | R3535S | |
| DTT | Sigma Aldrich | D5545-5G | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653-1kg | |
| KCl | Fisher | P217-500g | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266-100g | |
| PEG4000 | Fluka | 81240 | |
| nylon mesh | carolina | 652222N | |
| Tissue Culture Plates | USA Scientific | CC7682-7506 | |
| Razor Blades | Fisher | 12-640 | |
| hemacytometer | hausserscientific | 1483 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| EZNA plasmid miniprep kit | Omega | D6942-01 | |
| GeneJET Plasmid Miniprep Kit | Thermo Scientific | K0502 | |
| Centrifuge 5810 | eppendorf | 5811000827 | |
| Centrifuge 5424 | eppendorf | 22620401 | |
| Jencons Powerpette Plus Pipet Controller | Jencons | 14526-202 | |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss | N/A | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12450 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | Denville | C1018-P | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Denville | C1060-P | |
| Newborn Calf Serum | Thermo Scientific | 16010159 | |
| Soil | Ingram's Nursery | ||
| perlite | Vigoro | 100521091 | |
| Torpedo Sand | JKS Ventures | ||
| LB Broth, Lennox (Powder) | Fisher | BP1427-500 |
References
- Melchers, G., Labib, G. Somatic hybridisation of plants by fusion of protoplasts. Mol. Gen. Genet. 135 (4), 277-294 (1974).
- Gresshoff, P. M. In vitro culture of white clover: callus, suspension, protoplast culture, and plant regeneration. Bot. Gaz. 141 (2), 157-164 (1980).
- Lörz, H., Baker, B., Schell, J. Gene transfer to cereal cells mediated by protoplast transformation. Mol. Gen. Genet. 199 (2), 178-182 (1985).
- Hayashimoto, A., Li, Z., Murai, N. A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants. Plant Physiol. 93 (3), 857-863 (1990).
- Koop, H. -. U., et al. Integration of foreign sequences into the tobacco plastome via polyethylene glycol-mediated protoplast transformation. Planta. 199 (2), 193-201 (1996).
- Hrazdina, G., Wagner, G. J., Siegelman, H. W. Subcellular localization of enzymes of anthocyanin biosynthesis in protoplasts. Phytochemistry. 17 (1), 53-56 (1978).
- Lin, W., Wittenbach, V. A. Subcellular localization of proteases in wheat and corn mesophyll protoplasts. Plant Physiol. 67 (5), 969-972 (1981).
- Vögeli-Lange, R., Wagner, G. J. Subcellular localization of cadmium and cadmium-binding peptides in tobacco leaves. Plant Physiol. 92 (4), 1086-1093 (1990).
- Chen, S., et al. A highly efficient transient protoplast system for analyzing defence gene expression and protein-protein interactions in rice. Mol. Plant Pathol. 7 (5), 417-427 (2006).
- Wu, F. -. H., et al. Tape-Arabidopsis Sandwich-a simpler Arabidopsis protoplast isolation method. Plant methods. 5 (1), 16 (2009).
- Christensen, A. H., Sharrock, R. A., Quail, P. H. Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation. Plant Mol. Biol. 18 (4), 675-689 (1992).
- Marcotte, W. R., Bayley, C. C., Quatrano, R. S. Regulation of a wheat promoter by abscisic acid in rice protoplasts. Nature. 335 (6189), 454-457 (1988).
- Dron, M., Clouse, S. D., Dixon, R. A., Lawton, M. A., Lamb, C. J. Glutathione and fungal elicitor regulation of a plant defense gene promoter in electroporated protoplasts. P. Natl. A. Sci. USA. 85 (18), 6738-6742 (1988).
- Cocking, E. A method for the isolation of plant protoplasts and vacuoles. Nature. 187 (4741), 962-963 (1960).
- Zhang, H., et al. Transgenic rice plants produced by electroporation-mediated plasmid uptake into protoplasts. Plant Cell Rep. 7 (6), 379-384 (1988).
- Fromm, M., Taylor, L. P., Walbot, V. Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation. P. Natl. A. Sci. USA. 82 (17), 5824-5828 (1985).
- Crossway, A., et al. Integration of foreign DNA following microinjection of tobacco mesophyll protoplasts. Mol. Gen. Genet. 202 (2), 179-185 (1986).
- Holm, P. B., Olsen, O., Schnorf, M., Brinch-Pedersen, H., Knudsen, S. Transformation of barley by microinjection into isolated zygote protoplasts. Transgenic Res. 9 (1), 21-32 (2000).
- Schapire, A. L., Lois, L. M. A simplified and rapid method for the isolation and transfection of Arabidopsis leaf mesophyll protoplasts for large-scale applications. Plant Signal Transduction: Methods and Protocols. 1363, 79-88 (2016).
- Niedz, R. P. Regeneration of somatic embryos from sweet orange (C. sinensis) protoplasts using semi-permeable membranes. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 84 (3), 353-357 (2006).
- Sheng, X., et al. Protoplast isolation and plant regeneration of different doubled haploid lines of cauliflower (Brassica oleracea var. botrytis). Plant Cell Tiss. Org. 107 (3), 513-520 (2011).
- Grun, P., Chu, L. -. J. Development of plants from protoplasts of Solanum (Solanaceae). Am. J. Bot. 65 (5), 538-543 (1978).
- Davey, M. R., Anthony, P., Power, J. B., Lowe, K. C. Plant protoplasts: status and biotechnological perspectives. Biotechnol. Adv. 23 (2), 131-171 (2005).
- Pitzschke, A., Persak, H. Poinsettia protoplasts-a simple, robust and efficient system for transient gene expression studies. Plant methods. 8 (1), 14 (2012).
- Yoo, S. -. D., Cho, Y. -. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat. Protoc. 2 (7), 1565 (2007).
- Sedivy, E. J., Wu, F., Hanzawa, Y. Soybean domestication: the origin, genetic architecture and molecular bases. New Phytol. 214 (2), 539-553 (2017).
- Yang, Y., Li, R., Qi, M. In vivo analysis of plant promoters and transcription factors by agroinfiltration of tobacco leaves. Plant J. 22 (6), 543-551 (2000).
- Marion, J., et al. Systematic analysis of protein subcellular localization and interaction using high-throughput transient transformation of Arabidopsis seedlings. Plant J. 56 (1), 169-179 (2008).
- Wu, H. -. Y., et al. AGROBEST: an efficient Agrobacterium-mediated transient expression method for versatile gene function analyses in Arabidopsis seedlings. Plant methods. 10 (1), 19 (2014).
- Govindarajulu, M., Elmore, J. M., Fester, T., Taylor, C. G. Evaluation of constitutive viral promoters in transgenic soybean roots and nodules. Mol Plant Pathol. 21 (8), 1027-1035 (2008).
- Nagamatsu, A., et al. Functional analysis of soybean genes involved in flavonoid biosynthesis by virus-induced gene silencing. Plant Biotechnol. J. 5 (6), 778-790 (2007).
- Juvale, P. S., et al. Temporal and spatial Bean pod mottle virus-induced gene silencing in soybean. Mol. Plant Pathol. 13 (9), 1140-1148 (2012).
- Zhang, C., Bradshaw, J. D., Whitham, S. A., Hill, J. H. The development of an efficient multipurpose bean pod mottle virus viral vector set for foreign gene expression and RNA silencing. Plant Physiol. 153 (1), 52-65 (2010).
- Lin, W. Isolation of mesophyll protoplasts from mature leaves of soybeans. Plant Physiol. 73 (4), 1067-1069 (1983).
- Yi, J., et al. A single-repeat MYB transcription factor, GmMYB176, regulates CHS8 gene expression and affects isoflavonoid biosynthesis in soybean. Plant J. 62 (6), 1019-1034 (2010).
- Faria, J. A., et al. The NAC domain-containing protein, GmNAC6, is a downstream component of the ER stress-and osmotic stress-induced NRP-mediated cell-death signaling pathway. BMC Plant Biol. 11 (1), 129 (2011).
- Kidokoro, S., et al. Soybean DREB1/CBF-type transcription factors function in heat and drought as well as cold stress-responsive gene expression. Plant J. 81 (3), 505-518 (2015).
- Sun, X., et al. Targeted mutagenesis in soybean using the CRISPR-Cas9 system. Sci Rep-UK. 5, 10342 (2015).
- Karimi, M., Inzé, D., Depicker, A. GATEWAY™ vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends Plant Sci. 7 (5), 193-195 (2002).
- Xia, Z., et al. Positional cloning and characterization reveal the molecular basis for soybean maturity locus E1 that regulates photoperiodic flowering. P. Natl. A. Sci. USA. 109 (32), E2155-E2164 (2012).
