Un método Simple para el aislamiento de protoplastos de soja y aplicación al análisis de expresión génica transitoria
Summary
Hemos desarrollado un protocolo sencillo y eficaz para la preparación de grandes cantidades de protoplastos de soja para el estudio de complejos mecanismos de regulación y señalización en células vivas.
Abstract
Soja (Glycine max (L.) Merr.) es una especie de cultivo importante y se ha convertido en un modelo de leguminosas para los estudios de vías genéticas y bioquímicas. Por lo tanto, es importante establecer un sistema de expresión eficaz de genes transitorios en soja. Aquí, Divulgamos un protocolo simple para la preparación de protoplastos de soja y su aplicación para el análisis funcionales transitorios. Hemos encontrado que jóvenes unifolioladas hojas de plántulas de soja resultaron en grandes cantidades de protoplastos de alta calidad. Mediante la optimización de un método de transformación mediada por PEG-calcio, logramos eficiencia alta transformación mediante protoplastos unifolioladas soja. Este sistema proporciona un modelo eficiente y versátil para el examen de mecanismos complejos de regulación y señalización en células de soya vivo y puede ayudar a mejor entender diversos procesos celulares, fisiológicos y de desarrollo de las leguminosas.
Introduction
Protoplastos son células vegetales que han quitado las paredes celulares. Como sostienen la mayoría de características y actividades de las células vegetales, protoplastos son un buen modelo de sistema para observar y evaluar diversos eventos celulares y son herramientas valiosas para el estudio de hibridación somática1 y2de la regeneración de la planta. Protoplastos han sido también ampliamente utilizados para planta transformación3,4,5, ya que las paredes celulares lo contrario bloquearía el paso de DNA en la célula. Protoplastos poseen algunas de las respuestas fisiológicas y los procesos celulares de las plantas intactas, ofreciendo por lo tanto, valor fundamental en la investigación básica para el estudio de proteína subcelular localización6,7,8, de9,de las interacciones proteína-proteína10y promotor actividad11,12,13 en viven las células.
El aislamiento de protoplastos de plantas primero fue divulgado en 196014 y los protocolos de aislamiento y transformación de protoplastos se han desarrollado y optimizado. Un procedimiento estándar de aislamiento protoplasto implica el corte de hojas y digestión enzimática de las paredes celulares, seguido por separación de protoplastos liberados de restos de tejido no-digerido. Estrategias de transformación incluye electroporación15,16, microinyección17,18y polietilenglicol (PEG)4,5,19 métodos basados. Una amplia gama de especies se han divulgado éxito para el aislamiento del protoplasto, incluyendo cítricos20, Brassica21, Solanaceae22 y otras plantas ornamentales familias23,24. Tipos de tejidos diversos se utilizan en varias especies, un sistema de expresión transitoria en el protoplasto de mesófilo de Arabidopsis (TEAMP) aislado de hojas de la planta modelo Arabidopsis thaliana ha sido bien establecida25 y ampliamente adoptado para diversas aplicaciones.
Soja (Glycine max (L.) Merr.) es una de las más importantes proteínas y aceite de cultivos de26. A diferencia de Arabidopsis y arroz, obtención de plantas transgénicas de soja se sabe para ser algo difícil y baja eficiencia. Tumefaciens de la agrobacteria-mediada por la infiltración ha sido popularmente utilizada para estudios de expresión transitoria del gen en las células epidérmicas en tabaco27 y plántulas de Arabidopsis28,29, mientras que Agrobacterium rhizogenes ha sido utilizado para la transformación de las raíces pilosas en soja30. Enfoques de silenciamiento génico inducido por virus han sido utilizados para la desregulación de los genes del blanco31,expresión32 y transitorio33 de manera sistémica. Protoplastos proporcionan una alternativa versátil y valiosa a estos enfoques. Protoplastos pueden obtenerse materiales sobre tierra de soja y permiten la expresión del transgen rápida y sincronizada. Sin embargo, desde el éxito inicial aislamiento de protoplastos de soja en el 198334, ha habido informes limitados en el uso de protoplastos en soja35,36,37, 38, principalmente debido a la relativamente baja producción de protoplastos de soja.
Aquí, describimos un protocolo sencillo y eficaz para el aislamiento de protoplastos de soja y su aplicación para estudios de expresión génica transitoria. Utilizando hojas unifolioladas jóvenes de plántulas de soja, hemos sido capaces de obtener grandes cantidades de protoplastos vitales dentro de unas horas. Además, hemos optimizado un método de transformación mediada por PEG-calcio que es simple y de bajo costo para entregar ADN en protoplastos de soja con alta eficiencia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo para el aislamiento de protoplastos de soja y la aplicación a los estudios de expresión transitoria ha sido completamente probado y funciona muy bien en nuestro laboratorio. Los procedimientos son simples y fáciles y requieren equipo ordinario y mínimo coste. Nuestro protocolo produce grandes cantidades de protoplastos de uniforme y de alta calidad en comparación con métodos previamente divulgados34,35,36<su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el programa de investigación de genoma de planta de la National Science Foundation (NSF-PGRP-IOS-1339388).
Materials
| MES | Sigma Aldrich | M8250-100G | |
| Cellulase CELF | Worthington Biological Corporation | LS002611 | |
| Pectolyase Y-23 | BioWorld | 9033-35-6 | |
| CELLULASE "ONOZUKA" R-10 | yakult | 10g | |
| MACEROZYME R-10 | yakult | 10g | |
| Mannitol | ICN Biomedicals | 152540 | |
| CaCl2 | Fisher | C79-500g | |
| BSA | NEB | R3535S | |
| DTT | Sigma Aldrich | D5545-5G | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653-1kg | |
| KCl | Fisher | P217-500g | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266-100g | |
| PEG4000 | Fluka | 81240 | |
| nylon mesh | carolina | 652222N | |
| Tissue Culture Plates | USA Scientific | CC7682-7506 | |
| Razor Blades | Fisher | 12-640 | |
| hemacytometer | hausserscientific | 1483 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| EZNA plasmid miniprep kit | Omega | D6942-01 | |
| GeneJET Plasmid Miniprep Kit | Thermo Scientific | K0502 | |
| Centrifuge 5810 | eppendorf | 5811000827 | |
| Centrifuge 5424 | eppendorf | 22620401 | |
| Jencons Powerpette Plus Pipet Controller | Jencons | 14526-202 | |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss | N/A | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12450 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | Denville | C1018-P | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Denville | C1060-P | |
| Newborn Calf Serum | Thermo Scientific | 16010159 | |
| Soil | Ingram's Nursery | ||
| perlite | Vigoro | 100521091 | |
| Torpedo Sand | JKS Ventures | ||
| LB Broth, Lennox (Powder) | Fisher | BP1427-500 |
References
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